关于铅的酶催化荧光猝灭效应研究及其应用的研究

  作者：郑晓敏

目前，测定Pb的方法主要有原子吸收光谱法(AAS)、原子发射光谱法(AES)、紫外一可见分光光度法，X射线荧光光谱法，电化学分析法和化学发光法等。近年来，酶催化分析法广泛的应用于临床、医药、农业、工业过程检测等领域。牛血红蛋白和过氧化物酶具有相似的特性，可作为生物催化剂。实验发现，在NH3．H2O-NH4Cl缓冲溶液中，牛血红蛋白具有较强的催化作用，催化了过氧化氢和L酪氨酸的反应使之产生荧光，当存在痕量Pb时，体系的荧光强度显著降低。本文对Pb的酶催化荧光猝灭效应进行了研究并建立了一种测定Pb的方法

1  实验部分

1.1  主要仪器与试剂

    pHS-3C型酸度计（上海理达仪器厂）；Cary Eclipse荧光光谱仪（美国安捷伦科技公司）；BS210S电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

    Pb标准储备液：1.0g／L，准确称取0.304 0 g硝酸铅，用水溶解，转移至500 mL容量瓶摇匀，定容，保存在4℃冰箱中待用，使用时逐级稀释为Pb标准工作液；L-酪氨酸(L-tyrosine)溶液：1.0×10-3mol／L；H2 02：1.0×10- 3 mol／L；牛血红蛋白(Hemoglobin)溶液：1.O×10-5 mol／L; NH3.H2 ()-NH4Cl缓冲溶液(pH 10.4)：将0.1 mol／L NH4Cl溶液和0.1  mol／L NH3．H2()溶液按照体积比为1：8混合而成。

    所用试剂如无特别说明，均为分析纯；实验水均为二次蒸馏水。

1.2  实验方法

    在10 mL比色管中依次加入2.0mL NH3．H2O-NH4 CI缓冲溶液、1.8 mL 1.0×10 -3 mol／L。L_酪氨酸溶液、适量的Pb标准工作溶液、1.8 mLH202、0.8 mL 1.0×10-s mol／L牛血红蛋白溶液，用水定容至刻度。常温下反应15 min，在激发波长为317 nm，发射波长为405 nm时，用1.0cm比色皿，测定溶液的荧光强度F，。同上述步骤操作，测定空白溶液的荧光强度(Fo)，计算荧光强度差值即荧光强度猝灭值。

2  结果与讨论

2.1  荧光光谱

依实验方法，对荧光体系进行测定，绘制激发和发射光谱，如图1所示。从图1可见看出：在牛血红蛋白的催化作用下，H202能够和L-酪氨酸发生反应，产生荧光物质，其中最大激发波长为317 nm，最大发射波长为405 nm；当体系中加入不同体积的Pb标准工作液后，荧光强度有所降低，这说明Pb对H202氧化L-酪氨酸的体系具有一定程度的荧光猝灭作用。基于此建立了一种测定痕量Pb的荧光猝灭新方法。

2.2优化分析条件

2.2.1  酸度

    当NH3．H20-NH4 Cl缓冲溶液pH值分别为8.6～11.0时，考察了其对体系荧光猝灭效应的影响。试验发现：刚开始时，随着体系pH值的增大，AF逐渐增大；当pH值为10.4时，AF最大且稳定；当pH值继续增加时，AF逐渐减少。因此，实验选用NH3．H20-NH4Cl缓冲溶液的pH值为10.4。

2.2.2   1-酪氨酸溶液用量

    考察了L酪氨酸溶液的体积为0.5～2.5  mL时对体系猝灭效应的影响。试验发现：随着L酪氨酸溶液用量的增大，AF先增大后减少；当0酪氨酸溶液的用量为1.8 mL时，AF最大且稳定。所以，实验选用1.8 mL为L酪氨酸溶液的最佳用量。

2.2.3    H202用量

    试验了H202体积为1.5～2.1 mL时对体系荧光猝灭效应的影响。试验发现：随着H202用量的变大，AF先增大后减少；当H2 02溶液的体积为1.8mL时，AF最大且稳定。所以，实验选择1.8mL为H2 02的最佳用量。

2.2.4  牛血红蛋白溶液用量

    试验了牛血红蛋白溶液体积为0.3～1.0 mL时对荧光猝灭效应的影响。实验发现：随着牛血红蛋白溶液体积的增大，AF呈现先增加后减少的趋势；当牛血红蛋白溶液体积为0.8 mL时，AF最大。因此，实验选择0.8 mL为牛血红蛋白溶液的最佳用量。

2.2.5反应时间和反应温度

    在常温下进行了反应时间的考察试验。结果表明：刚开始时，随着反应时间的延长，AF逐渐增加；反应时间为15 min时，AF趋于平衡，且在1 h内基本保持不变。考虑到虽然温度升高有利于反应尽快达到平衡，但是当温度超过25℃时，会加速H202的分解。因此，实验选择荧光体系在常温下反应15 min。

2.3  分析方法特性

按照实验方法，加入一系列不同浓度的Pb标准工作液进行测定。结果表明，Pb的质量浓度在1. 6～18 mg/L范围内与AF有良好的线性关系，其线性回归方程为

，其中，r为线性相关系数，n为实验组数，即不同质量浓度Pb标准工作液的组数（通常，n较大时线性方程更准确）。对空白溶液连续测定11次，得到空白标准偏差s，以3s／k（k为校准曲线斜率）计算得到方法检出限为0.2 mg/L。对2 mg/L铅标准工作液进行11次平行测定的相对标准偏差为2.9%。

3  样品分析

    将工业废水过滤后取250 mL蒸馏。取适量馏出液，按照实验方法对样品中的Pb进行测定。同时将上述样品适当稀释后，按照分光光度法进行对照试验，并将测定结果进行统计处理，结果见表1。由表1可见：实验方法测定值与分光光度法相符。当测定次数n=5，概率p=0.95时，t的理论值为2. 78，由表1中数据可知，两个样品的t检验值均小于理论值，表明实验方法准确可靠。

4摘要：在碱性介质中，牛血红蛋白能够催化过氧化氢氧化L酪氨酸，使之产生荧光，而铅对其产生的荧光具有猝灭效应。研究了铅的酶催化荧光猝灭效应并将其应用于痕量铅的测定。在pH 10.4的NH3．H202NH4Cl缓冲溶液中，当L-酪氨酸、H202和牛血红蛋白的浓度分别为1.8×10 4 mol／L，1.8×10-4 mol／L和8．o×10。mol／L时，在常温下反应15 min后，于激发波长为317 nm，发射波长为405 nm处，用1.0 cm比色皿测定体系的荧光强度猝灭值(AF)。实验表明，铅在质量浓度为1. 6～18 mg／L范围内与体系的AF呈良好的线性关系。方法检出限为0.2 mg/L。将体系应用于废水中痕量铅的测定，结果与光度法测定结果基本一致，相对标准偏差（RSD，n=5）为3.3%-3.6%。将平行测定5次结果进行t检验，所得t检验值均小于理论值，表明实验方法具有良好的准确性。