作者：张毅
间甲酚( m-cresol)是苯酚的甲基取代物之一，但相比邻甲酚和对甲酚更难降解，其毒性很高，即使在很低浓度下对生命体也有很严重的毒害作用，常伴随苯酚出现在工业废水中。因此，有效去除水中酚类化合物对保护水环境安全的意义不言而喻。
去除废水中酚类化合物主要有物理化学法、化学法和生物法3类，生物法因经济和环境保护上的优势被越来越多地关注和研究。尽管酚类物质有较高毒性，仍然发现有微生物能够同时降解苯酚和间甲酚。葛启隆等从处理焦化废水的活性污泥中分离出一株苯酚高效降解菌，经鉴定为波茨坦短芽孢杆菌（Brevibacillus borstelensis），苯酚降解能力达1 600mg/L。但是，波茨坦短芽孢杆菌降解间甲酚以及双底物降解特性还未被研究。
本研究以波茨坦短芽孢杆菌为对象，考察其降解间甲酚的特性和生长动力学，并研究双底物体系中，苯酚和间甲酚的相互影响和动力学，同时研究酚类物质的降解途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验菌株
波茨坦短芽孢杆菌（Brevibacillus borstelensis），本实验室从处理焦化废水的活性污泥中分离得到。
1.1.2 培养基
选择培养基( g/L)：NH4N03 0.5，Na2HP04 7.9，KH,PO。1.5，MgS04·7H20 0.1，pH 7.0，微量元素溶液2 mL，苯酚和间甲酚利用0.2μm孔径纤维膜过滤除菌，在接种前按需要量加入培养基中。
富集培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCI 10，pH 7.0。
以上培养基，所有的试剂（除苯酚和间甲酚），枪头及带有棉塞的锥形瓶用高压蒸汽灭菌器在121℃灭菌20 min，固体平板和斜面培养基均在上述培养基中加入2%的琼脂粉。
1.2 实验方法
1.2.1 降解实验
菌株在富集培养基中培养至对数期末期，取菌体离心分离，用pH 7.2的磷酸盐缓冲液连续洗涤菌体两次，再次离心去上清液，沉淀菌体重悬于pH 7.2的磷酸盐缓冲液中，制成菌悬液。
按5%的接种量将菌悬液接种到50 mL含有苯酚/间甲酚的选择培养基中，在30℃、160 r/min条件下培养，研究菌株生长和间甲酚降解特性，及苯酚和间甲酚的相互作用。每隔适宜时间取样检测培养液中的菌体含量和残余苯酚/间甲酚含量。
1.2.2 酶活性测定
1.2.2.1 粗酶液的制备
取对数生长期后期菌液4℃高速离心5 min，弃上清液收集菌体。菌体用磷酸盐缓冲液( pH=7.2，0.2mol/L)清洗2次，再次重悬于磷酸盐缓冲液，置于冰水混合物中，用超声破碎仪破碎细胞10 min(破碎30s，间歇30 s)。4℃、12 000 r/min下离心20 min，收集上清液，上清液即为粗酶液。
1.2.2.2 酶活力测定
(l)苯酚羟化酶活性测定。3 mL反应体系中含苯酚4.5μmo1，NADPH 4.5μmol，粗酶提取液0.6mL，磷酸缓冲液250 μmol，pH=7.4，30℃水浴5min，在340 nm处测定的NADP+的生成速度来表征苯酚羟化酶的活性。一个单位的苯酚羟化酶的活性被定义为每分钟氧化1μmo1/L NADPH所需的酶量。
(2)邻苯二酚1，2-双加氧酶(C120)活性测定。3 mL反应体系中含邻苯二酚1.5μmol，EDTA l.5μmol，粗酶提取液0.6 mL，磷酸缓冲液250 ymol，pH=7.4。30℃水浴5 min，在260 nm处测定的产物顺，顺一粘糠酸生成速度来表征Cl20的活性。一个单位的邻苯二酚1，2-双加氧酶的活性被定义为每分钟产生
1 μmol/L顺，顺一粘糠酸所需的酶量。
(3)邻苯二酚2，3-双加氧酶(C230)活性测定。3 mL反应体系中含邻苯二酚1.5μmol，粗酶提取液0.6 mL，250μmol磷酸缓冲液，pH=7.4。30℃水浴5min，在375 nm处测定的产物2一羟基粘糠半醛生成速度来表征C230的活性。一个单位的邻苯二酚2，3-双加氧酶的活性被定义为每分钟产生lμmol/L 2-羟基粘糠半醛所需的酶量。
以上实验结果为3次重复的平均值。
1.3 测定和分析方法
菌体浓度的测定采用光密度法和恒重干燥法，建立OD600和细胞干重的线性关系；苯酚和间甲酚浓度用高效液相色谱仪(HPIC)测定，色谱条件：AgilentXDB-Cl8分析色谱柱(4.6 mmx250 mm，5μm)，流动相甲醇：水(60:40)，流速1 mL/min，柱温30℃，UV检测波长270 nm；总蛋白含量用Bradford法测定，酶的比活力以每毫克的蛋白质中所含酶的活力单位数计算。
2 结果与讨论
2.1 间甲酚降解及动力学
2.1.1 波茨坦短芽孢杆菌对间甲酚的降解
细胞生长和间甲酚降解曲线如图1所示。初始间甲酚浓度为200、300、400 mg/L，降解完所需时间分别为44、56、72 h。随着底物浓度增大，细菌生长的延滞期增长，这表明底物浓度越高，其对菌体的抑制作用越强。间甲酚的消耗主要用于细胞生长和细胞能量代谢。从图1可见，随着间甲酚浓度的增加，最终细胞浓度也相应提高。但是初始间甲酚浓度从200 mg/L增加到300 mg/L时，最终细胞浓度约增加了33.1mg/L，而从300 mg/L增加到400 mg/L时，最终细胞浓度只增加了12.2 mg/L。这是因为在高浓度下，底物对细胞生长的抑制作用增强，间甲酚更多地作为能源用于维持细胞活性，而不是用来合成细胞。
2.1.2 细胞生长动力学
菌体在不同间甲酚初始浓度下的比生长速率用公式(1)计算。
式(1)中，μ为细胞比生长速率(h-1)；yx为细胞生长速率；Cx为细胞浓度(mg/L)。
由于间甲酚对细胞生长有抑制作用，采用Hal-dane方程描述菌体降解间甲酚的动力学，见公式(2)。
式(2)中，μmax为细胞最大比增长速率(h-1)；S为限制性底物浓度( mg/L)；Ks为半饱和系数（mg/L）；Ki为底物抑制系数(mg/L)。
运用ORIGIN8.0软件处理实验数据，将细胞的比生长速率与对应的初始底物浓度进行非线性最小二乘拟合得到动力学模型各参数：μnax =0.226 h-1，Ks=18.19 mg/L,K-130.12 mg/L(R2=0.991).μmax表示菌体利用底物的最大潜力，菌体降解间甲酚的μ一小于降解苯酚的(0.334 h_)，表明波茨坦短芽孢杆菌降解间甲酚的能力弱于对苯酚的降解。K越小，表明底物浓度较低时就会对细胞产生较强的抑制作用，菌体降解间甲酚的K小于降解苯酚的( 196.89 mg/L)，表明间甲酚对细胞生长的抑制作用更强。
从图2可见，菌体的最大比生长速率出现在很低的间甲酚浓度。当间甲酚浓度40 mg/L时，最大比生长速率为0.127 h-1。之后，随着间甲酚浓度增加，比生长速率下降。
2.2 双底物降解及动力学
苯酚初始浓度为600 mg/L，间甲酚初始浓度为100-200 mg/L的双底物降解特性如图3所示。当间甲酚浓度为100 mg/L时，苯酚降解时间延长了8 h；但间甲酚浓度为200 mg/L时，600 mg/L苯酚降解所需时间增加38 h。间甲酚浓度越高，对苯酚降解的抑制作用越强烈。同理，苯酚的存在也延缓了间甲酚的降解。在含有600 mg/L苯酚的体系中，200 mg/L间甲酚降解增加30 h。尽管苯酚的浓度比间甲酚高，但菌体仍然优先利用苯酚作为碳源和能源，间甲酚降解主要在整个降解过程的末期完成。
间甲酚初始浓度为200 mg/L，苯酚初始浓度为150-350 mg/L的双底物降解特性如图4所示。尽管高浓度苯酚对间甲酚降解有抑制作用，但低浓度的苯酚对间甲酚降解有促进作用。当体系中苯酚浓度150-300 mg/L时，200 mg/L间甲酚降解时间均会缩短，且200 mg/L是促进间甲酚降解的最佳苯酚浓度。苯酚相对间甲酚更容易被菌体利用，细胞代谢活性升高，间甲酚降解速率比没有苯酚时的降解速率大。当苯酚浓度达到350 mg/L，苯酚对菌体的抑制作用开始发挥主要作用。在苯酚一间甲酚双底物体系中，促进和抑制作用一直存在，两者的竞争导致不同的降解速率。
由于苯酚、间甲酚存在交叉抑制并且都抑制细胞生长，本研究用Abuhamed等提出的方程描述苯酚一间甲酚双底物体系细胞生长动力学，见式(3):
式(3)中，下标1表示苯酚，下标2表示间甲酚；μmax、Ksi和Kji均为单底物降解时的动力学参数；Iij表示底物i对底物j的抑制程度，数值越大表示抑制作用越大。基于双底物降解实验数据，用非线性最小二乘拟合得到，I 1.2=1.70，I 2.1=2.84，相关系数R2=0.89。结果表明，间甲酚对苯酚降解的抑制作用要强于苯酚对间甲酚降解的抑制。
2.3 酚类化合物降解途径
邻苯二酚双加氧酶是芳香化合物代谢的关键酶。底物在苯酚羟化酶的催化下生成（取代的）邻苯二酚，然后被邻苯二酚1，2-双加氧酶催化邻位开环或者邻苯二酚2，3一双加氧酶催化间位开环，之后被进一步降解进入TCA循环。通过测定苯酚羟化酶、邻苯二酚1，2一双加氧酶和邻苯二酚2，3-双加氧酶的活性，可以初步推测波茨坦短芽孢杆菌菌株降解间甲酚的代谢途径。波茨坦短芽孢杆菌粗酶活性检测结果如表1所示。
从表1可知，波茨坦短芽孢杆菌在降解酚类化合物时，苯酚羟化酶和邻苯二酚1，2-双加氧酶表现出较高的比活力，而邻苯二酚2，3-双加氧酶几乎没有活性，因此推断该菌株降解苯酚和间甲酚都遵循邻位开环途径。底物在苯酚羟化酶作用下转化成（取代的）邻苯二酚，接着在邻苯二酚1，2-加氧酶催化下邻位开环转化成顺，顺一粘糠酸，进一步降解，最终生成琥珀酸CoA和乙酰CoA，进入TCA循环。这与Ren Yuan等研究Citrobacter farmeri获得的实验结论一致。
实验数据表明，在间甲酚为单底物的降解体系中，苯酚羟化酶和邻苯二酚1，2-双加氧酶的比活力明显弱于降解苯酚时的比活力。降解体系中苯酚的存在提高了2种酶的比活力，结果再次证明了苯酚对间甲酚降解的促进作用。
3 结论
(1)波茨坦短芽孢杆菌能够利用间甲酚作为唯一碳源和能源，最大降解能力达到400 mg/L，间甲酚浓度越高，对菌体抑制作用越强。细胞生长动力学(Hal-dane方程)参数为：μmax=0.226 h-1，Ks=18.19 mg/L，Ki=130.12 mg/L，相关系数(R2)为0.991，实验数据很好地符合Haldane方程。动力学方程参数表明，间甲酚对菌体的抑制作用要强于苯酚。
(2)在苯酚一间甲酚双底物降解体系中，间甲酚抑制苯酚的降解，反之亦然。150-300 mg/L的苯酚能促进200 mg/L间甲酚的降解，缩短间甲酚降解时间，苯酚200 mg/L时，间甲酚降解速率最快。波茨坦短芽孢杆菌优先利用苯酚作为能源和碳源。双底物细胞生长动力学研究表明，间甲酚对苯酚降解的抑制要强于苯酚对间甲酚降解的抑制。
(3)苯酚和间甲酚在降解过程中遵循相同的降解途径：底物在苯酚羟化酶作用下转化成（取代的）邻苯二酚，接着在邻苯二酚l，2一加氧酶催化下邻位开环转化成顺，顺一粘糠酸，进一步降解，最终生成琥珀酸CoA和乙酰CoA，进入TCA循环。
4摘要：研究了波茨坦短芽孢杆菌降解间甲酚的特性及双底物体系中苯酚和间甲酚的相互作用。结果表明，波茨坦短芽孢杆菌能在72 h内降解400 mg/L的间甲酚，但其降解间甲酚的能力低于苯酚，拟合的Haldane方程各动力学参数为：μmax=0.226 h-1，Ks=18.19 mg/L,
K,=130.12 mg/L。在苯酚一间甲酚体系中，苯酚抑制问甲酚的降解，同样间甲酚也抑制苯酚的降解；但是低浓度苯酚能促进间甲酚的降解，苯酚浓度150-300 mg/L时，能促进200 mg/L间甲酚的降解，苯酚200 mg/L时，间甲酚降解速率最快；动力学参数表明间甲酚对苯酚降解的抑制要强于苯酚对间甲酚降解的抑制。酶活测定表明，苯酚和间甲酚降解都遵循邻位降解途径：生成（取代的）邻苯二酚，然后在邻苯二酚1，2一双加氧酶作用下邻位开环裂解。
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