作者：郑晓敏
大豆皮过氧化物酶( Soybean seed coat peroxidase，SBP)含量很高，其稳定性要高于广泛应用的辣根过氧化物酶，而且其催化活性和底物范围也要优于辣根过氧化物酶[2-5]。SBP有望代替辣根过氧化物酶，在免疫组织化学、电镜技术、酶联反应和免疫印迹等生物学研究中得到广泛应用，成为重要的诊断试剂，也有望在废水处理中发挥巨大作用。因此，SBP具有广阔的应用前景。对大豆皮中过氧化物酶的提取工艺进行了优化，以期为大豆皮过氧化物酶的研究和开发利用提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1材料及仪器
黄豆（市售）；愈创木酚（99%，化学纯）、30% H202、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、95%乙醇等，均为国产分析纯。
WFZ UV-2000型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；HH-S 6数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；A104电子天平：梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司；TDL-5-A高速离心机：上海安亭科学仪器厂。
1.2方法
1.2.1 SBP酶活的测定方法
SBP活力测定采用愈创木酚法[6]。试验严格按照酶活测定的初速度法要求，将酶液进行适当稀释，采用连续监测法测定酶活。以每分钟光密度( OD470)变化0.01为1个酶活力单位。具体操作为：
取两支试管，1支为参比管，1支为测定管，向测定管中加入0.05 mol/L pH 6.0的磷酸缓冲液2.7 mL，1%的H202（现配现用）0.1 mL，4%的愈创木酚溶液（95%乙醇作溶剂、现配现用）0.1 mL，于25℃水浴预热5 min，加入0.1 mL酶液，迅速混匀，以参比管（用蒸馏水代替测定管中的酶液，其他试剂添加量不变）为对照，于470 nm下每隔30 s记录一次吸光度，直到初速度结束（反应速度明显下降）为止。根据初速度范围内的OD470变化，计算酶的浓度（比活力）。
式中：t-初速度反应时间，min；AOD470-时间t内的光密度变化值；0.01-每分钟光密度(OD470)变化0.01为1个酶活力单位，U；0.1-酶液体积，mL；n-酶液稀释倍数。
1.2.2 SBP提取工艺流程
1.0 g大豆皮->0.04 mol/L的pH 6.0磷酸缓冲液水浴浸取->5 000 r/min离心10 min->取上清液，适度稀释后迅速测定酶活，计算过氧化物酶的得率：
式中：x-提取液中酶的比活力，U/mL；V-提取液体积，mL; m-大豆皮质量，g。
1.2.3 SBP提取单因素试验
考察不同液料比、提取时间、提取温度和提取次数对酶活的影响，不同因素各水平均做2次平行试验，结果以平均值表示。在研究提取时间的影响时，还对提取液放置过程中酶活的变化进行了考察。
1.2.4 SBP提取的正交试验设计
根据单因素试验结果，设计三因素三水平正交试验，通过极差分析找到最优组合，并对最优组合条件进行验证。
2结果与分析
2.1 SBP酶活测定中反应时间的确定
将酶液适当稀释（2倍），加入反应体系中，记录470 nm处吸光度的变化规律，结果如图1所示。0 min时，吸光度为0.07；随着时间增加，吸光度线性增加，OD470变化率约0.12 min;3 min时吸光度为0.415，接着吸光度增加开始减慢，在4 min后，吸光度增加明显减慢。这是因为随着反应的进行，底物减少使得酶促反应速度下降。根据初速度法测酶活的要求，应选择0～3 min为测定范围。
2.2单因素试验结果
2.2.1 提取温度对SBP得率的影响
不同提取温度对SBP得率影响的试验结果（图2）表明：温度为20℃时，SBP得率为5.17×103 U/g;随着温度的升高，酶得率逐渐增加，在温度为30℃时得率最高，为6.52×103 U/g；当温度超过30℃时，酶得率随温度的升高而下降。其原因可能是温度的升高促进了SBP溶解，但是超过30℃以后，酶部分失活，或随着其他热不稳定物质一起沉淀，所以SBP得率下降。因此，30℃为提取适宜温度。
2.2.2液料比对SBP得率的影响
不同液料比对SBP得率影响的试验结果（图3）表明：液料比为10：1(mL/g)时，酶得率为4.97×103 U/g，随液料比的增大，酶得率也在增加；当液料比为20：1(mL/g)时，酶得率为6.49×103 U/g，之后得率上升趋势变缓，并趋于稳定。由此可知，液料比的增加有利于酶的提取，这可能是因为随着溶剂体积的增加，促进了酶的溶解扩散。由于液料比20：1(mL/g)之后酶得率上升的趋势缓慢，从节省成本的角度考虑，选择液料比20：1(mL/g)为最佳。
2.2.3 提取时间对SBP得率的影响
不同提取时间对SBP得率影响的试验结果（图4）表明：当提取时间为3h时，酶的得率为5.85×103 U／g，随着提取时间的延长，酶的得率逐渐增加，在Sh时得率最高，为7.0×103 U/g，当提取时间再延长时，酶得率逐渐下降。
选取某次提取的酶液，测定其在常温（约25℃）下放置不同时间的酶活，结果（表1）显示：随着放置时间的延长，提取液的酶活力持续下降，下降比例约每小时5%。
因此，在提取过程中，时间的延长有利于原料中的SBP溶解出来，但同时溶解出来的酶也在不断丧失活力，5h时提取量达到最大，因此，采用提取时间5 h较为适宜。另外，提取的酶液须迅速测定酶活，以免造成结果偏低。
2.2.4提取次数对SBP得率的影响
不同提取次数对SBP得率影响的试验结果（图5）表明：第1次的酶得率为6.87×103 U/g，占前5次总得幸的63.62%；第2次的酶得率为2.97×103 U/g，占前5友总得率的27.48%；第3次的酶得率为0.59×103 U/g，占前5次总得率的5.44%；第4和第5次的酶得率已非常低，因此，增加提取次数，可以增加SBP得率，但是从节省成本的角度考虑，提取1次为最佳。
2.3正交试验结果
根据单因素试验结果，选取提取温度、液料比和提取时间进行三因素三水平的正交试验。结果见表2，因素主次次序依次为：提取温度>液料比>提取时间。3个因素的优水平组合是A3B2C2，即温度400C，液料比20：1(mL/g)，提取时间5h。
根据正交试验得出的最优条件，进行3次验证性试验，得率分别为6.97×103，7.26×103和7.28×103 U／g，均值为7.17×103 U/g，高于正交试验各组提取率，
证明优化结果可靠。
3结论与讨论
通过单因素试验及正交试验得到了提取SBP的最佳工艺条件：提取温度40℃，液料比20：1(mL/g)，提取时间5h，提取次数1次，SBP得率高达7.17×103 U/g，高于一些文献中的提取率。高晶晶等用响应面法优化了大豆皮中SBP的提取条件，得到的最佳提取率为2.6×103 U/g[7];王志兵等从豆壳中提取纯化SBP，得到的SBP酶活较低，约200 U/50 g[8]，这可能是材料差异造成的，也可能是由于提取时间太长（35℃下24 h），造成SBP大量失活。
SBP的稳定性较高，对热、pH等有很强的稳定性，70℃以内较稳定[2-3]。赵杨等对SBP酶活测定方法进行优化，发现70 0C是测定酶活性的理想温度[9]。但在本试验中，最佳提取温度为40℃，50℃及以上就出现酶活下降，这可能是由于高温下时间太长造成SBP大量失活，也可能是因为在50 0C以上，大量杂蛋白变性，其沉淀时包裹带出了SBP，造成SBP得率下降。
SBP酶活测定采用连续监测的初速度法，不宜用酸终止法，因为反应产物4-甲氧基苯酚在酸性条件下不稳定，也易造成酶活测定值偏低[10]。由于酶液浓度高，需要进行适当稀释，保证酶促反应在0~3 min内匀速进行，即初速度范围，以测得准确的酶活，否者加入过多的酶会造成测定值较实际值低。
4、 摘要
以黄豆为原料，对大豆皮过氧化物酶(SBP)的提取条件进行优化。通过单因素试验和正交试验考察水浴温度、液料比、水浴时间和提取次数对SBP得率的影响。结果显示SBP的最佳提取条件为液料比20：1(mL/g), 40℃水浴提取时间5h，提取1次。此条件下的SBP得率为7.17×103 U/g。
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