关于 二氢杨梅素对细菌形态及呼吸代谢影响的探索

     作者：张毅

研究表明，二氢杨梅素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、链球菌、黑曲霉、绿脓杆菌、牛奶酸败菌等均具有较好的抑菌效果，但关于二氢杨梅素抑菌机制的研究仍鲜见相关报道；药物对细菌的抑制作用，主要是通过破坏细胞膜

及细胞壁的渗透性、抑制蛋白质的合成和影响细菌的呼吸代谢等途径来实现。试验率先研究了二氢杨梅素对金黄色葡萄球菌的形态结构和呼吸代谢的影响，为改善二氢杨梅素的抑菌性能及其定向改性提供理论依据，为开发纯天然、毒副作用小、价格低廉的二氢杨梅素类的防腐剂和药物奠定基础。

1  材料与方法

1.1材料与设备

    二氢杨梅素，纯度95%以上，实验室自制，简称DMY;金黄色葡萄球菌菌株，由南昌大学中德联合研究院提供；磷酸盐缓冲液( PBS)、乙醇、戊二醛：天津市福晨化学试剂厂；碘乙酸，丙二酸，磷酸钠，六甲基二硅氨烷、四氧化锇、醋酸异戊酯：天津市光复科技发展有限公司。

    JSM-6701F冷场发射扫描电子显微镜：日本电子株式会社；HA-80便携式微量溶解氧仪：北京恒奥德仪器仪表有限公司；GNP9160隔水式恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TGL-12C型台式高速离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；MLZ-HWY-2102C型恒温振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；SW-CJ-ICU双人单面垂直洁净工作台：苏洁净化设备有限公司。

1.2试验方法

1.2.1  DMY对细菌形态结构的影响

    采用扫描电镜观察DMY加入前后菌体形态结构的变化。具体步骤为：将培养24 h的金黄色葡萄球菌加入到含有DMY的肉汤培养基中(DMY质量浓度为110 mg/L)，接种量5%，于摇床中培养(37℃．130 r/min)。从加DMY培养开始计时，每隔4，14，24 h分别取培养基中菌液3 mL，离心弃上清液(3 000r／min)，收集菌体，菌体沉淀用0.1 mol/L的PBS缓冲液洗涤3次。洗涤后的菌体沉淀用2.5%的戊二醛溶液固定，放入冰箱冷藏1~2 h后用PBS缓冲液冲洗，用1%的四氧化锇固定1~2 h，使用PBS缓冲液再次冲洗。分别使用50%，70%和90%浓度的酒精各浸泡8 min，然后用100%酒精脱水10 min，用醋酸异戊酯浸泡30 min以上。将脱水后的菌体涂到金属箔片上，用六甲基二硅氨烷( HMDS)干燥3 min，干燥好的菌体粉末用导电胶黏附喷金3～5 min，上机镜检观察，记录结果并拍照。正常未加DMY的金黄色葡萄球菌同上制备，作为对照组。

1.2.2  DMY对细菌呼吸代谢的影响

1.2.2.1  呼吸速率的测定

    呼吸速率是指单位时间、单位质量微生物的耗氧量。在反应杯中加入pH为7.2，浓度为0.1 mol/L的PBS缓冲液3.6 mL，1%葡萄糖溶液0.4 mL，含菌量106 CFU/mL的金黄色葡萄球菌菌液1 mL，露空搅拌5min，开始用微量溶解氧仪测定菌悬液中的溶氧量变化（计算初始呼吸速率R0），测定时保证整个系统处于密封状态，试验重复3次，取平均值。

1.2.2.2呼吸抑制率的测定

    用注射器分别加入三种典型抑制剂（丙二酸、碘乙酸和磷酸钠，终质量浓度为500 mg/L）和DMY（终质量浓度为110 mg/L），加药后封闭反应系统，轻轻摇动反应杯，用微量溶解氧仪测定加药后菌液中溶氧量变化（计算末呼吸速率R1），计算得到呼吸抑制率IR。以不加抑制剂和DMY组为对照，试验重复3次，取平均值。

1.2.2.3  呼吸叠加率的测定

    在反应杯中加入pH为7.2，浓度为0.1 mol/L的PBS缓冲溶液3.6 mL，1%葡萄糖溶液0.4 mL，含菌量106 CFU/mL的金黄色葡萄球菌菌液1 mL，加入DMY使其终质量浓度为110 mg/L，加入DMY后轻轻摇动反应杯，保证整个系统密封，用微量溶解氧仪测定菌液中溶氧量变化（计算末呼吸速率R1），再分别加入三种典型抑制剂：丙二酸、碘乙酸、磷酸钠，使终质量浓度为500 mg/L，封闭系统，轻晃反应杯，测菌液溶氧量变化（计算同时加入典型抑制剂和DMY后菌液的叠加呼吸速率R2），计算得到典型抑制剂对DMY的Ⅱ乎吸叠加率DR，重复试验3次，取平均值。呼吸抑制率和呼吸叠加率的计算公式为：

    式中，IR-呼吸抑制率；DR-呼吸叠加率，R0-初始呼吸速率；R1-分别加入抑制剂和DMY的末呼吸速率；R2-同时加入抑制剂和DMY的呼吸速率。

2结果与讨论

2.1  DMY对菌体形态结构的影响

    DMY对金黄色葡萄球菌菌体形态结构的影响见图1。扫描电镜下，正常作用4h后的细菌表面光滑，菌体饱满，折光性好，见图1(A)。而经DMY作用4h后菌体表面开始产生褶皱，变得粗糙，见图1 (B)。正常作用14 h后细菌依旧表面光滑，菌体饱满，见图

1(C)。而DMY作用14 h后的细菌开始皱缩，变得不饱满，表面产生凹陷，囊泡和不规则突起状结构，见图1(D)。正常作用24 h后细菌表面开始出现轻微粗糙，但并无异状结构产生，整个菌体仍然饱和成型，见图1(E)。而DMY作用24 h后细菌严重皱缩、干瘪、扭曲变形，有的菌体已发生明显萎缩并融为一体，见图1(F)。由图得知，DMY作用后的金黄色葡萄球菌，其菌体形态结构与对照组相比已经发生了明显的变化

2.2 DMY对细菌呼吸代谢的影响

    细胞分解葡萄糖主要有三种途径：  (1) TCA: 有氧条件下，葡萄糖经三羧酸循环( TCA)彻底氧化成水和二氧化碳；(2) EMP:无氧条件下，葡萄糖经糖酵解途径( EMP)生成乳酸或乙醇；  (3)HMP:葡萄糖经戊糖磷酸途径提供呼吸代谢的中间产物。

    丙二酸、碘乙酸和磷酸钠分别是TCA、EMP和HMP途径的典型抑制剂。DMY抑制细菌呼吸代谢的具体途径可通过比较3种典型抑制剂对DMY的呼吸叠加率来判断，呼吸叠加率越小，表明DMY与典型抑制剂间的增效作用越弱，DMY与典型抑制剂抑制相同代谢途径的可能性就越大。典型抑制剂和DMY对金黄色葡萄球菌的呼吸抑制率和呼吸叠加率的影响见表1和表2。

    结果表明，DMY同其它三种典型呼吸抑制剂一样，对金黄色葡萄球菌的呼吸代谢具有抑制作用，且抑制效果明显。同时，DMY对丙二酸的呼吸叠加率最小，对磷酸钠的叠加率最大，这说明DMY主要是通过三羧酸循环( TCA)途径来抑制整个菌体的呼吸代谢，具体的抑制部位和方法还需要进一步研究。

3结论

    1) DMY作用后的金黄色葡萄球菌，其菌体形态结构与对照组相比有明显的变化，菌体出现严重皱缩、干瘪、扭曲变形等现象，说明DMY对菌体的形态结构有明显的破坏作用。

    2) DMY同其他三种典型呼吸抑制剂一样，对金黄色葡萄球菌的呼吸代谢具有抑制作用，且抑制效果明显。DMY对丙二酸的叠加率最小，对磷酸钠的叠加率最大，这说明DMY主要是通过三羧酸循环(TCA)途径来抑制整个菌体的呼吸代谢，具体的抑制部位和方法还需进一步研究。

3)率先从细菌形态及呼吸代谢的角度对DMY的抑菌机理行了初步探索，下一步将继续从细胞渗透性、蛋白质合成等方面进行研究，然后在综合试验结果和分析数据的基础上，确定DMY抑菌的关键靶点，进而推测DMY的抑菌机制。

4、摘要

以金黄色葡萄球菌为供试茵，通过扫描电镜观察和呼吸抑制试验，研究二氢杨梅素对细菌形态及呼吸代谢的影响。试验结果表明，二氢杨梅素作用后的金黄色葡萄球菌，其茵体形态与对照组相比有明显的变化，菌体出现严重皱缩、干瘪、扭曲变形等现象。二氢杨梅素对金黄色葡萄球菌的呼吸代谢具有明显的抑制效果，并主要通过三羧酸循环(TCA)途径来抑制整个菌体的呼吸代谢，具体的抑制部位和方法还需进一步研究。