多位点序列分析在食品用双歧杆菌分类鉴定中的新用途

作者：胡晓辉

    双歧杆菌成为近年来食品、药品研究开发的热点，部分菌株大量用于婴幼儿配方食品、保健食品、药品的生产中。但双歧杆菌发挥有益功能具有很强的菌株特异性，为此FAO/WHO益生菌评价指南中指出，精确的菌株识别是益生菌使用的前提。因此，规范食品行业菌种的管理和评价程序，建立准确、快速的双歧杆菌鉴定体系非常重要。

    16S rDNA基因序列分析是研究分类的重要手段，但对亲缘关系比较近的物种分辨率不高，相对于保守的16S rDNA，部分管家基因(Housekeeping Gene)具有更高的分化程度，使用多位点序列分析( Multi-locus Sequence Analysis，MLSA)的方法对这些管家基因进行分析，可以建立比较准确且可信的物种间关系，并且通过对双歧杆菌中管家基因的研究，可以为菌株的快速检测和鉴定提供基础。试验采用clpC( coding for a protease),fusA( GTP-binding elongation factor EF-G),gyrB( DNAgyrase, subunit B),ileS( isoleucyl-tRNAsynthetase),purF( amidophosphori-bosyltransferase),rplB( 50S ribosomal subunit proteinL2)和rpoB( beta-subunit of RNA polymerase) 7个管家基因的部分序列对我国法规规定允许在食品中使用的5个双歧杆菌菌种共12株双歧杆菌菌株进行系统发育分析，为建立准确、快速的双歧杆菌鉴定体系提供基础和线索。由于市场中，乳双歧杆菌在样品中添加较为多见，所以试验中使用了多株乳双歧杆菌。

1  材料与方法

111材料

1.1.1  基因组序列和16S rDNA序列

  基于卫生部的公告和现有的双歧杆菌全基因组序列，试验挑选12株双歧杆菌；12株双歧杆菌全基因组序列下载于致病系统资源整合中心( Patho Systems Resource Integration Center，PATRIC)，基本信息如表1。

1.1.2管家基因参考序列

    7个管家基因的参考序列下载于多位点序列分型( Multi-Locus Sequence Typing，MLST)数据库，参考基因长度分别为：clpC 603 bp，fusA 666 bp，gyrB 627 bp, ileS 489 bp, purF 591 bp, rplB 357 bp以及rpoB 501 bp。

2方法

2.1  管家基因序列识别

    使用BLASTv2.2.26将7个管家基因的参考序列比对到12株双歧杆菌基因组上，使用的E值为le-20，使用自编PERL脚本对基因组中与参考序列比对上的序列进行提取，并人工对序列的边界进行确认。

2.2系统发育分析

    使用MEGA5分别对16S rDNA、7个管家基因以及管家基因按次序串联的序列进行系统发育分析，系统发育分析时使用MEGA内置的ClustW进行序列比对，使用最大似然模型构建系统发育树，构建系统发育树时使用的碱基替换模型为Kimura 2参数矩阵，使用自举法（Bootstrap）对系统发育树进行检验，检验时使用的Bootstrap值为1 000。

3结果

3.1管家基因的基本信息

    在12株双歧杆菌的7个管家基因中，clpC，ileS，purF，rplB和rpoB的基因长度与参考序列长度一致，对于fusA，在B.breve,B.longum subsp. infantis和B.longum subsp. longum中发现3 bp的缺失，缺失位置在481 bp附近，其他菌株的fusA长度与参考序列一致（图1A）；

对于gyrB，B．adolescentis和B．blfidum中发现3 bp缺失，在B．adolescentis中，序列缺失位置在312 bp附近，在B．bifidum中，缺失位置在323 bp附近（图1B）。对于双歧杆菌属中B．animalis subsp．lactis菌株，5个管家基因序列完全一致，其中ATCC27673菌株与其他5个B．animalis subsp. lactis菌株相比，clpC序列上存在微小差异(99.83%)，ileS序列间差异较大(90.49%)。

3.2  16S rDNA系统发育树

  对12株双歧杆菌的16S rDNA序列构建系统发育树，从整体上看，16S rDNA构建的系统发育树的大部分分支获得较高的Bootstrap值(>80)，系统发育树将12株双歧杆菌明确地分为两大分支，一支为B．animalis，另一支为B.acbLescentis,B.blfzdum,B.breve和B.longum（图2）。

3.3单基因系统发育

通过对管家基因的部分核苷酸序列进行系统发育分析后，得到7棵系统发育树，从整体上看，7棵系统发育树的中均存在较低Bootstrap值(<80)的分支；在这些系统发育树中，B．animalis subsp. lactis菌株和B．an-imalis subsp．animalis菌株的分类位置在7个基因的系统发育树中一致，而其他5个菌株在7棵系统发育树中的位置不固定，如在clpC系统发育树中，B．longum subsp.infantis与B．longum subsp. longum在同一分支，在usA的系统发育树中，B．longum subsp. longum与B．breve在同一分支；其他非B．animalis存在同样的情形（图3）。

3.4多基因系统发育树

将管家基因的序列，按clpC，fusA，gyrB，ileS，purF，rplB和rpoB的顺序依次串联后，得到串联的核苷酸序列，通过对串联的核苷酸序列进行系统发育分析后，得到基于串联序列的系统发育树。从整体上看，通过多基因串联获得的系统发育树的各个分支均获得了较高的Bootstrap值(>80)，并且多基因串联的系统发育树拓扑结构与16S rDNA系统发育树一致，但具有更高的分辨率（图4）。

4讨论

随着食品工业的快速发展，双歧杆菌作为益生菌的一大类，已经被应用于多种食品的添加。然而，益生菌作用具有菌株特异性，精确的菌株识别是益生菌广泛使用的前提。试验中对卫生部65号文《可用于食品的菌种名单》中允许使用的5个双歧杆菌菌种中12个代表菌株进行MLSA分析，比较了7个管家基因间序列差异；并且，试验分别对7个管家基因，管家基因的串联序列以及12个双歧杆菌的16S rDNA序列进行系统发育分析，为双歧杆菌的快速鉴定和分类提供依据。

管家基因序列分析显示B．breve，B．longum subsp.infantis和B．longum subsp. longum的fusA存在3 bp的缺失；B．adolescentis和B．bifidum的gyrB存在3 bp缺失；其中B.breve,B.longum subsp. infantis和B.longum subsp.longum缺失位置一致，B．adolescentis和B．bifidum的缺失为菌种特异性缺失。这一结果与Alexis Dele'toile等对B.breve,B.longum subsp.infantis,B.longum subsp.longum和B．bifidum等菌株的相应基因序列长度的研究结果一致，B．adolescentis的缺失则需要进一步验证；以上基因片段的缺失信息可以为菌株的快速检测提供线索。

管家基因系统发育分析结果说明其序列组成各有特性，部分基因过于保守，如clpC和rplB，使用这些基因构建系统发育树时，亚种内菌株水平上的系统发育树分支获得的Bootstrap值较低，如B．animalissubsp.lactis分支，因此，单独使用这些基因可能获得不准确的分类结果；部分基因在菌种间的分化程度较高，如ileS和pruF等，使用这些基因构建系统发育树时，尽管亚种内菌株水平的系统发育树分支获得较高Bootstrap值，但菌种水平上系统发育树分支的Bootstrap值较小，因此，单纯使用分化程度较高的基因作为菌种水平上的分类，可能会引入随机误差，造成分类模糊。Sudhindra R．Gadagkar等认为，单基因的系统发育树只能代表基因在物种间的进化关系，只有多个基因系统发育分析才能正确反映物种间的关系。

管家基因串联序列的系统发育分析结果表明，多基因串联的系统发育分析能够获得可靠的分支以及稳定的分类结果。试验中多个管家基因串联的系统发育分析结果能够在亚种的水平上将双歧杆菌进行分类，并且系统发育树中的各个分支均获得较高的Bootstrap值。多基因系统发育树的拓扑结构与基于16S rDNA的系统发育树的一致，并且多基因系统发育树具有更高的分辨率；试验中使用的多基因系统发育分析，可以为将来亚种水平上双歧杆菌的分类提供了参考和线索。尽管使用多基因串联的方式进行分析仍然无法有效区分6个B．animalis subsp. lactis菌株，这提示我们，B．animalis subsp. lactis亚种内基因组序列特别保守，单纯的从基因的角度可能无法在双歧杆菌的亚种内对菌株进行分类，所以需要探索更加精确的分类方法，如全基因组测序，全基因组水平的单核苷酸多态性，结合生理生化指标等。

未来的双歧杆菌分类鉴定中，使用全基因组测序的方式将成为重要的发展方向，特别是对于一些使用传统的16S rDNA序列分型方式无法被准确分类的菌株。但是目前，由于成本和周期等原因，全基因组测序尚无法被应用于双歧杆菌的快速鉴定和分类，所以从全基因组水平上筛选更多合适的基因用于双歧杆菌菌株鉴定和分类，是重要和可行的研究方向之一。

5结论

在12株双歧杆菌中，B．breve，B．longum subsp.infantis.B.longum subsp. longum,B.adolescentis和B.bifidum中片段缺失可以为这些菌株的快速鉴定提供线索；使用7个管家基因串联序列构建的系统发育树与基于16S rDNA构建的系统发育树具有一致的拓扑结构，并且多管家基因系统发育树具有更高的分辨率。

6摘要  

双歧杆菌是一类被广泛应用于食品工业的益生茵，准确、快速地分类和鉴定双歧杆菌对其应用和管理具有重要意义。选择了可在食品中使用的双歧杆菌菌种中的12个代表菌株，使用多位点分析的方法对其16S rDNA和7个管家基因进行研究，从系统发育的角度讨论利用多基因串联的方式对双歧杆菌属建立稳定可靠的分类方法的可行性。研究发现双歧杆菌属中部分菌株存在特异性序列缺失，可以为菌株的快速检测提供线索；多基因系统发育分析较16S rDNA分析方法分辨力更高，可应用于食品中双歧杆菌的分类鉴定。