作者：郑晓敏
B-甘露聚糖酶(Endo-l，4-/3-D-mannanase；mannohydrolase; EC3.2.1.78)，属于半纤维素酶类，广泛应用于饲料、造纸、食品、医药、纺织印染等方面，在饲用酶制剂方面应用尤其广泛，添加,B-甘露聚糖酶可降解饲料中含有的甘露聚糖，有助于解除甘露聚糖对机体胰岛素分泌和胰岛素样生长因子生成的抑制作用，提高葡萄糖吸收效率，促进碳水化合物代谢过程，是一种优良的饲料添加剂，同时也是抗生素的理想代替品。
毕赤酵母表达系统作为目前应用广泛的真核表达系统，已有超过500种外源蛋白获得成功表达，但据现有报道，B-甘露聚糖酶在毕赤酵母工程菌中表达量偏低，为此，试验一方面通过基因工程构建工程菌，优化基础培养基、补料、溶氧、温度、甲醇补料方式以及菌体浓度等发酵条件，使B-甘露聚糖酶在30 L发酵罐水平达到29 600 U/mL，达到工业化生产要求；与此同时，为从根源解决毕赤酵母发酵工业生产中发酵周期长、酶蛋白比活力较低等问题，试验采用在构建成功的工程菌株中共表达伴侣蛋白来解决该问题。有研究表明，当外源蛋白过量表达时．会造成酵母分泌途径的超载，导致内质网中工具酶含量相对减少，致使蛋白错误装配折叠，使目的蛋白的表达量出现瓶颈。分子伴侣概念由Laskey等于1978年提出，它能帮助蛋白质正确折叠，提高蛋白活性，研究发现共表达分子伴侣，如二硫键异构酶( Protein disulfideisomerase，PDI)能显著改善这一状况，提高外源蛋白分泌效率，Damasceno等在毕赤酵母中共表达免疫球重链结合蛋白( Heavy chain binding protein，Bip)，使目的蛋白表达量提高两倍。
试验以酵母基因组为模板克隆毕赤酵母Bip及PDI基因，将其插入表达载体pPICZaA中，电击转人B-甘露聚糖酶工程菌Pichia pastoris GS115/Ppic9K-3-MAN（简写为GM115），构建共表达伴侣蛋白PDI菌株GS115/Ppic9K-ye-MAN/pPICZaA-PDI(简写为PM115)和共表达伴侣蛋白Bip菌株GS115/Ppic9K-)6-MAN/pPICZaA-Bip（简写为BM115），通过30 L发酵罐高密度发酵，测定B-甘露聚糖酶酶活、比活力、菌体密度和蛋白总量等参数，研究共表达伴侣蛋白对毕赤酵母产B-甘露聚糖酶的影响。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株及质粒
B-甘露聚糖酶表达菌株Pichia pastoris GS115/Ppic9K-18-MAN、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a和质粒pPICZaA均由实验室保存。
1.1.2主要试剂
限制性内切酶AsuⅡ，Not I，Sac I，T4DNA连接酶等均购自宝生物工程（大连）有限公司；G418和Zeocin购自上海生工生物工程有限公司；蛋白分子量标准购自赛默飞世尔科技公司，核酸分子量标准，EasyPfu DNA Polymerase，酵母基因组提取试剂盒，质小量抽提试剂盒，纯化试剂盒等购自北京全式金生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.1.3培养基
LB培养基：氯化钠10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L; YPD培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L;发酵基础培养基：葡萄糖2.5%, KH2P04 5g/L, CaS04 3g/L, K2S04 15 g/L,MgS04 15 g/L, NH4H2P04 35 g/L, KOH 4.2 g/L, 12 mL/L微量元素；分批补料培养基：50%甘油含12 mL/L微量元素）；诱导剂：100%甲醇（含12 mL/L微量元素）；补料培养基：NH4H2P04 200 g，CaS04 20 g，K2S04 100 g，MgS04 100 g，定容至2 L；微量元素溶液：参照Invitrogen表达手册。
1.2方法
1.2.1引物设计及合成
使用Primer Premier 5，Olig0 7.0软件进行引物设计，分析，根据Gen Bank公布的毕赤酵母PDI基因序列( EU805807)设计引物：
Fl:5’-AGTTCGAAACGATGCAATTCAACTG-GGATATTAAAACTGTG-3’（下划线处引入AsuⅡ酶
切位点）。F2:5’-TAAAGCGGCCGCTTAAAGCTC-GTCGTGAGCGTCTCJCCTCACTTTC-3’（下划线处引入Not I酶切位点）。
根据Gen Bank公布的毕赤酵母Bip基因序列 ( AY965684)设计引物： F3:5’-AGTTCGAAACGATGCTGTCCTTAAAAC-CATCTTGGCTGACTTTGGCGGC-3’（下划线处引入AsuⅡ酶切位点）。F4:5’-TAAAGCGGCCGCCTA-CAACTCATCATGATCATAGTCATAGTCGTAGTCA-3’（下划线处引入Not I酶切位点）。
由于PDI，Bip基因来自酵母基因组，因此重新设计工程菌菌落PCR验证引物：
F5:5’-AATTGCGACTGGTTCCAATTGAC—3’。 F6:5’-ATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGT-3’。
所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.2重组质粒的构建与转化
提取酵母基因组DNA作为模板，分别以F1与F2，F3与F4为引物，进行PCR扩增。PDI基因扩增条件为：94℃预变性5 min; 94℃30 s，56℃退火30 s，72℃延伸3 min，循环30次；72℃后延伸10 min；Bip基因扩增条件为：94℃预变性5 min; 94℃30 s，580C退火30 s，72℃延伸4.5 min，循环30次；72℃后延伸10 min。将PCR扩增得到的目的片段进行纯化，双
酶切，并与同样经过双酶切的表达载体pPICZaA分别连接，转化感受态大肠DH5a，利用Zeocin(100ug/mL)筛选抗性菌落，PCR鉴定重组质粒，且送交上海生工生物工程有限公司测序，测序正确后得到重组质粒pPICZaA-PDI和pPICZaA-Bip。两个重组质粒别分经Sac I线性化后，电击转化至GM115中。
1.2.3重组菌株的筛选和摇瓶复筛
将电击转化产物涂布于含100，200和300u g/mL的Zeocin梯度YPD平板（且含500u g/mL的G418），30 0C培养3～4 d，至菌落出现。原始菌株为非Zeocin抗性，只有重组质粒pPICZaA-PDI或pPICZaA-Bip整合入GM115基因组中，才能在含有Zeocin和G418的抗性YPD平板上生长。分别挑取两种重组工程菌，使用TaKaRa的Lysisbuffer提取酵母基因组，以F5，F6为引物进行菌落PCR（未展示菌落PCR图），条件为：94℃预变性5 min；94℃30 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min，循环30次；72℃后延伸10 min，16℃保温；Bip基因扩增条件为：94℃预变性5 min, 94℃30 s，58℃退火30 s，72℃延伸4.5 min，循环30次；72 0C后延伸10 min。
挑取经PCR验证正确的重组菌株，接种至YPD液体摇瓶培养基中，30℃，240 r/min，培养至OD600约等于8.0，按10%接种量接人发酵基础培养基中，28 0C，240 r/min培养24~30 h，初始碳源耗尽后，补充1 mL50%甘油，甘油耗尽后饥饿培养0.5 h，每24 h补充100%甲醇0.4 mL，发酵120 h，取上清测定酶活力，从PDI共表达菌株中筛选酶活力最高的重组菌命名为PM115，从Bip共表达菌株中筛选酶活力最高的重组菌命名为BM115。
1.2.4 30 L发酵罐放大试验
发酵罐装液量60%，控制pH 5.5，YPD种子罐移种后，调节转速400 r/min，温度30℃，空气流量1m3/h，罐压0.05 MPa，进行分批发酵，基础培养基中碳源耗尽后，溶氧值急速上升，此时以15 mL/(L．h)速度流加50%甘油，含12 mL/L的PTM1），稳定罐压为0.08 MPa，调节通气量，搅拌速度控制溶氧为20%左右。
当菌体质量浓度达到30 g/L左右时，停止流加甘油，饥饿40 min，耗尽细胞内残留的甘油。诱导阶段采取连续补料方式添加甲醇(含12 mL/L的PTM1)，初始流加速度为1 mL/ (L - h)，之后每小调节转速为800 r/min，温度28.5℃，空气流量4~6 m3／h，罐压0.1 MPa，同时离线检测甲醇体积分数在0.08%±0.02%左右，控制DO为10%~20%，诱导B-甘露聚糖酶基因表达。
1.2.5 甲醇浓度检测
采用气相色谱测定分析甲醇浓度。
1.2.6B -甘露聚糖酶酶活测定方法
采用DNS法测酶活力，酶活力单位定义：在37℃，pH 5.5的条件下，每分钟从质量浓度3 mg/mL的甘露聚糖( Sigma G0753)溶液降解释放1umol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。
1.2.7细胞质量浓度测定方法
细胞干质量（80℃烘干）与发酵液体积之比即为细胞质量浓度，根据测量数值绘制线性回归曲线，细胞干重与OD600的关系为：DCW=0.2260D600+0.017( R2=0.989 2)。
1.2.8发酵液中总蛋白含量测定方法
采用考马斯亮蓝染色法测定发酵液中总蛋白含量。
2结果与分析
2.1 Bip，PDI基因PCR扩增产物及重组克隆质粒的鉴定
Bip基因PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，在约2 000 bp处可见特异的DNA条带，PDI基因在约1 500bp处可见明显DNA条带，大小与预期相符（图1）。重组表达质粒pPICZaA-PDI，pPICZaA-Bip双酶切产物( AsuⅡ，Not I)经1%琼脂糖凝胶电泳分析，均可见与目的基因大小相符的目的条带（图2），且测序结果与Gen Bank中基因序列一致，表明重组质粒构建正确。
2.2胞内Bip，PDI蛋白表达的鉴定
甲醇诱导5d后，离心取菌体，破碎细胞提取胞内总蛋白，经SDS-PAGE分析，可见相对分子量约70kDa的Bip特异性条带以及分子量约57 kDa的PDI特异性条带（图3），大小与预期相符，说明伴侣蛋白在毕赤酵母内成功表达。
2.3共表达伴侣蛋白对产酶和菌体生长的影响
对菌株BM115，PM115和GM115在30 L发酵罐中进行B-甘露聚糖酶的发酵研究，其菌体生长和产酶过程如图4所示，PM115菌体浓度和产酶曲线与初始工程菌GM115基本一致，未见明显效果；而BM115生长速度略低于另外两株，但菌体终质量浓度基本一致，达到130 g/L左右，且最高酶活均在达到最大菌体质量浓度时出现，说明菌体质量浓度与酶活存在正相关，符合毕赤酵母发酵的一般规律，但BM115最高酶活达到40 900 U/mL，是GM115和PM115的1.4倍，发酵30 h内，不同菌株生长速度相同，在初始碳源耗尽后，菌体质量浓度均达到30 g/L左右，说明共表达基因对诱导前菌体增殖并无影响。图5表明，从发酵60 h开始到发酵结束，BM115表达的总蛋白和比酶活均高于其余两株，最高蛋白质量浓度达到13.22 g/L，较其余两株高出2 g/L，同时这也与图4中B-甘露聚糖酶酶活的变化曲线相符。PM115在蛋白表达量和比酶活方面，同样与原始工程菌G M115基本一致，表明PDI基因未对毕赤酵母正常生理反应和表达3-甘露聚糖酶形成影响。
在相同工艺流程下，不同工程菌菌体质量浓度差距并不明显，且发酵终点菌体浓度相当，但BM115表达的目的蛋白含量，酶活力别为13.22 g/L和40 900 U／mL，明显高出其余两株，这是由于共表达伴侣蛋白Bip能够促进蛋白质快速正确折叠，减少细胞内错误配对引起的蛋白降解，这对于高菌体密度，高表达量的毕赤酵母发酵过程尤其重要。图4中，发酵70 h
后，菌株已经表达较多的伴侣蛋白Bip，使得图5曲线表现为总蛋白和比酶活同期加速增长，这充分说明了共表达Bip目的基因对于提高目的产物有明显作用。
3讨论
在毕赤酵母表达外源蛋白过程中，大部分分泌蛋白以折叠肽段的形式进入内质网，并在内质网腔内折叠，成熟，然后才能被主动运输，这就要求有一套高效，精确的动态平衡机制，如果未折叠的蛋白质在内质网中过度积累，将会超出细胞的处理和承受能力，从而影响细胞正常代谢途径，此时会激活细胞内的折叠蛋白反应( Unfolded protein response，UPR)，这种反应会间接激活相关伴侣蛋白，折叠因子等基因的转录翻译，生成的伴侣蛋白促进内质网中
蛋白的折叠效率，加强细胞处理未折叠蛋白的能力，帮助细胞回归正常代谢活动。
试验在毕赤酵母基因工程菌种分别共表达伴侣蛋白Bip和PDI，经30 L发酵罐放大试验，发现并不像诸多报道中PDI对酶活力有较大提升的效果。造成这种结果的原因与目的蛋白的特异性有关，PDI作为分子伴侣，能催化蛋白质形成二硫键（氧化活性）以及催化错配二硫键的重排（异构酶活性），同时还具有分子伴侣活性，它主要功能在于增强新生肽段在内
质网中二硫键生成效率，从而提高蛋白质的正确折叠率和比活性，但通过基因序列分析发现，该B-甘露聚糖酶仅有两个二硫键，通过研究对比发现，共表达PDI与原始菌株没有明显差异，一方面原因，当错误折叠发生时，二硫键错配蛋白结合游离的PDI，使其浓度下降而激发UPR，之后细胞合成的PDI数量足够应对细胞内出现的错配蛋白，及时缓解了其对细胞正
常生理功能和代谢产生的压力，也就是说该B-甘露聚糖酶高水平表达的负面影响因素并不是多聚体；另一方面原因，该工程菌表达目的蛋白量达到10 g/L以上，共表达PDI时所带来的正向效应与其对细胞造成的合成压力相当，导致没有明显效果。
毕赤酵母共表达伴侣蛋白Bip的研究较少，Bip作为Hsp70家族中唯一定位于内质网中的伴侣蛋白，能够识别转运到ER内的新生多肽，并帮助其正确折叠，同时还能将错误折叠的蛋白质逆向转运出ER，且Bip蛋白具有ATP酶活性，能够水解ATP提供其作用于蛋白质折叠所需的能量。试验发现共表达Bip时，其一方面同内质网中未折叠的疏水氨基酸结合，防止在合成过程中的不正确折叠，因此图5显示BM115菌株较原始菌株GM115比酶活有明显提高；另一方面Bip能协同目的蛋白，防止新合成的蛋白在转运过程中变性或断裂，提高了目的蛋白的表达总量，图4和图5显示，在60 h后，相对于初始工程菌B-甘露聚糖酶
的总蛋白，总酶活以及呈加快上升趋势，使发酵终点上清总蛋白达到13.22 g/L，据目前报道，此蛋白含量已接近毕赤酵母表达系统的峰值。
4结论
试验分别构建丽株共表达伴侣蛋白毕赤酵母工程菌，并分析了共表达伴侣蛋白Bip和PDI对毕赤酵母表达B-甘露聚糖酶的影响，经试验验证，较为常用的 PDI对目的蛋白未有提高，而较少用于毕赤酵母的Bip却效果明显。在30 L发酵罐上，经十余次重复试验，实现了B-甘露聚糖酶的高效表达，使发酵上清液总蛋白达到13.22 g/L，酶活40 900 U/mL，具有工业化应用价值。
5摘要
通过分别共表达伴侣蛋白PDl和Bip获得B-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达。根据Gen Bank公布的毕赤酵母PDI和Bip序列设计引物，以酵母基因组为模板PCR扩增目的基因片段，插入表达载体pPICZaA，分别整合到B-甘露聚糖酶工程茵中，筛选共表达二硫键异构酶的重组酵母(PM115)和共表达免疫球重链结合蛋白的重组酵母(BM115),在30 L发酵罐水平上分析两种共表达伴侣蛋白菌株与初始菌株(GM115)对B-甘露聚糖酶表达的差异。相
同工艺下，PM115与原始菌株相比未有提高，而BM115发酵产酶能力高于原始菌株，最高酶活达到40 900 U/mL,最高总蛋白表达量13.22 g/L，最高比酶活达到3 150 U/mg,分别比初始菌株提高38%, 22%和18%。毕赤酵母基因工程菌GM115通过共表达伴侣蛋白Bip，提高了B-甘露聚糖酶的产量和比活力，达到工业化生产水平。
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