作者：张艺馨
在我国油橄榄主要分布在甘肃、广东、广西、云南、四川等省区。每年有大量橄榄果渣目前尚未被完全开发和利
用，造成资源的浪费。
植物蛋白具有资源丰富、价格低廉、能量转化效率高、几乎不含胆固醇和饱和脂肪酸等优点，逐渐成为人类主要的蛋白质来源。因此，研究植物蛋白的精深加工技术，开发高附加值产品，具有良好的经济效益。一般橄榄果渣中油脂的含量在6%～10%之间，蛋白质占11%左右，是一种未能利用的蛋白原料。因此，对油橄榄果渣的综合利用，要充分考虑到橄榄蛋白的利用问题。目前国内外提取植物蛋白的方法有：碱法提取、酶法提取、复合提取、膜分离提取㈣、离子交换提取等。水相酶法工艺是在油料破碎时加水，以水为分散相，再加酶进行酶解，使油脂易于从油料粒子中释放出来，利用非油成分（蛋白质和碳水化合物）对油和水的亲和力的差异，同时利用油水比重的不同而将油和非油成分分离。酶解处理后，经离心或压滤固液分离，固相（其中含有不溶性蛋白质）干燥后生产饲料，液相破乳后采用离心或洗涤等方法取得油和蛋白质。该工艺可以同时分离油料中的油和蛋白质，可用于花生、向日葵、橄榄和棉籽等。用酶处理可提高油脂得率，而温和的酶处理条件对脱脂后油料饼粕的进一步利用有较大好处，但因有效酶制剂（主要是纤维素酶、果胶酶等）成本较高而影响了该法的应用。
主要针对这些不足，以冷榨后的橄榄果渣为原料，采用Asl.398中性蛋白酶，旨在于温和的处理条件下探索出一条可行的提取蛋白工艺。试验拟选择中性蛋白酶进行试验，并对影响酶作用的因素进行研究，以确定最佳酶解工艺条件。
1 材料和方法
1.1原料、试剂与设备
1.1.1主要原料
橄榄果渣，新鲜冷榨橄榄果渣；酶制剂，中性蛋白酶，20万u/g:广西南宁庞博生物工程有限公司。
1.1.2主要试剂
氢氧化钠(AR)：天津南开化工厂；盐酸( AR)：天津市凯通化学试剂有限公司；柠檬酸( AR)：天津化学试剂有限公司；三氯乙酸( AR)：上海山浦化工有限公司；磷酸氢二钠( AR)：天津石英钟厂霸州市化工分厂；碳酸钠( AR)：上海虹光化工厂；甲醛(AR)：武汉华松精细化工有限公司；福林酚试剂，实验室自制。
1.1.3主要仪器与设备
离心机TD-5:湖南凯达科学仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市英峪予华仪器厂；FD-8冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；ZD-2A自动电位滴定仪：上海鹏顺科学仪器有限公司；722型分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司。
1.2测定方法
橄榄果渣水分的测定，采用GB/T 5009.3-2003，105℃恒重法；粗蛋白的测定，采用GB/T 5009.3-2003，微量凯氏定氮法；粗脂肪的测定，GB/T5009.3-2003，索氏提取法；粗纤维的测定，GB/T5009.3-2003；灰分的测定，GB/T 5005-1985，550℃灼烧法；酶活力的测定，中性蛋白酶活力的测定：GB/T 28715-2012；蛋白质水解度(DH)测定，甲醛
滴定法。
1.3工艺流程
脱脂橄榄果渣经过粉碎、过筛，称量50 g按1：10( g/mL)料液比加蒸馏水浸泡2次，每次3h，在90℃水浴锅中加热15 min，然后在相应的条件下酶解，用3mol/L柠檬酸溶液调节pH 4.2—4.5进行灭酶，在4 000 r／min条件下，离心15 min，测定其水解度。
1.4试验方法
1.4.1水相酶法单因素试验
1.4.1.1酶解温度对水解度的影响
在加酶量0.5%，pH 7.0，反应时间3.0 h，酶解温度分别为35℃，40℃，45℃，50℃和55℃条件下，测定不同温度下的水解度。
1.4.1.2 pH对水解度的影响
在加酶量0.5%．酶解温度45℃，反应时间3.0 h，pH分别为6.0，6.5，7.0，7.5和8.0条件下，测定不同pH下的水解度。
1.4.1.3加酶量对水解度的影响
在pH 7.0，酶解温度45℃，反应时间3.0 h，加酶量分别为0.1%，0.3%，0.5%，0.7%和0.9%条件下，测定不同加酶量下的水解度。
1.4.1.4反应时间对水解度的影响
在加酶量0.5%，pH 7.0，酶解温度45℃，反应时间分别为1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 h条件下，测定不同酶解时间下的水解度。
1.4.2 中性蛋白酶的响应面分析(Response surfacemethodology，RSM)
影响水解的各个因素并不是孤立的发生作用，他们之间存在相互关联。因此酶解必须考虑到酶解温度、pH、加酶量和反应时间各个因素的相互影响。根据Box-Behnken中心组合设计原理，以相关性密切的四个因素酶解温度、pH、加酶量和反应时间为自变量，水解度为响应值设计了四因素三水平（见表1）共27个试验点的响应面，以研究所选的四个因素对中性蛋白酶水解橄榄果渣的综合影响。
2结果与分析
2.1酶解温度对水解度的影响
由图1可知，随着温度的增加，水解度逐渐增大；在45℃时，酶解的水解度最大；当温度超过45℃后，随着温度的升高，水解度呈下降趋势，且下降趋势明显。这是因为温度过高，使得酶蛋白的结构发生改变，造成酶活性降低。因此，选择确定响应面分析中温度的三个水平是40℃，45℃和50 oC。
2.2 pH对水解度的影响
由图2可知，随着pH增大，水解度增加趋显著势；当pH大于7.0时，再增大其pH，水解度反而降低。这是因为pH对酶反应的影响，主要表现对在酶活力的影响，其只发生在非常窄的范围内，试验选用中性蛋白酶，过酸或过碱都会影响其活性。蛋白酶和底物蛋白质都含有解离基团，只有这些解离基团处于特定的解离状态时，酶与底物蛋白才结合最快，生成产物的速度最快。体系的pH直接影响着酶和底物蛋白质分子的某些解离基团的解离状态，只有在特定的pH条件下，酶和底物蛋白质的解离基团才处于结合，转化为产物的最佳解离状态。因此，试验选择确定响应面分析中pH的三个水平为6.5．7.0和7.5。
2.3加酶量对水解度的影响
由图3可知，水解度随着加酶量的增加而增大，在加酶量低于0.5%时，水解度增加明显，几乎呈直线上升趋势；当加酶量高于0.5%时，随着加酶量的增大，水解度增加缓慢。在实际应用过程中，通常会考虑到经济效益。因此，把酶的添加量定在0.5%左右。故试验选择确定响应面分析中加酶量的三个水平为0.3%．0.5%和0.7%。
2.4酶解时间对水解度的影响
由图4可知，在酶解时间在的0—3 h时，水解度变化明显；大于3h后，水解度增加趋势缓慢。这主要是因为酶解开始时酶活力高，产物抑制小；随着水解时间的延长，到达3.0 h后酶的活力逐渐降低，同时游离的肽增多对产物的抑制增加。水解3h即可达到很好的效果，在实际应用过程中，再延长反应时间将会增加生产成本，降低经济效益。因此，选择确定响应面分析中酶解时间的三个水平为2.5，3.0和3.5 h。
2.5酶解橄榄果渣的响应面试验数据分析
根据Box-Behnken中心组合设计原理，以相关性密切的四个因素：酶解温度、pH、加酶量和反应时间为自变量，水解度为响应值，得到响应面试验数据分析表见表2。
2.5.1优化试验结果的计算与分析
通过SAS统计分析软件，进行回归方程分析，确定相关系数R=0.946 6；水解度的回归方程为：Y=-88.868 906+0.346 017X1+12.917 667X2+51.803 125X3+19.524 833X4-0.015 103X12+0.166 900X2X1-1.045 333X22+0.105 000X3XI-5.4OO OOOX3X2-12.123 958X32-0.086 000XX-0.850 000X4X2-1.525 000X4X3-1.394 833 X42，回归模型方差分析见表3。
从回归模型方差分析表可以看出，回归显著水平F为0.015，其值小于0.01，说明水解度与因素之间有非常显著关系，由回归方程可以计算得出酶解的最佳工艺条件为：温度42.5℃、pH 7.0、加酶量0.6%、时间3.1 h，该条件下得到的最佳水解度为8.62%。
2.5.2最佳参数的验证试验
按回归方程计算出酶解最佳工艺条件：温度42.5℃、pH 7.0、加酶量0.6%、时间3.1 h，进行验证试验，得到该条件下水解度为8.58%。
2.5.3 响应面分析
响应面分析方法的图形是特定的响应面Y对因素X1、X2、X3、X4构成一个三维空间。从试验所得的响应面分析图上可以分析出它们之间的相互作用。
由图5可知，当温度在45℃左右，pH为6.7—7.2时，两因素的交互作用对水解度影响最大；由图6可知，在一定的范围内，随着温度的升高，水解度增大；加酶量在0.55%时，水解度趋于平缓；由图7可知，随着温度的升高和时间的增加，水解度增大，温度42℃—45℃．3.0 h左右时，温度和时间的交互影响最大；由图8可知，pH和加酶量两个因素对水解度影响显著；由图9可知，pH 6.8—7.2和时间2.8—3.1 h时，两因素的交互作用最佳；由图10可知，加酶量在0.56%左右和时间3.0—3.2 h时，两因素的交互作用最佳。由图5~图10可以看出，试验所选择的四个因素值是合理的，验证了试验的正确性。
3结论
1)酶解温度、pH、加酶量和反应时间是水相酶法提取蛋白质的显著影响因子，分析表明其显著度顺序为：加酶量>反应时间>pH>酶解温度。
2)通过中性蛋白酶酶解的单因素试验和响应面分设计分析得出，Asl.398中性蛋白酶对脱脂橄榄果渣的酶解最佳工艺条件为：温度42.5℃、pH 7.0、加酶量0．6%、时间3.1 h，水解度可达8.58%。
4摘要
采用中性蛋白酶对预处理过的脱脂橄榄果渣进行酶解从而提取橄榄蛋白，以酶解温度、pH、加酶量、反应时间为单因素进行单因素酶解研究，并在单因素基础上以水解度为响应值对酶解条件进行响应面分析，得到酶解最佳工艺条件为：反应温度42,5℃、pH 7.0、加酶量为0.6%、酶解时间3.1 h，水解度达8.58%。
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