关于多种种保鲜剂对冷鲜猪肉中假单胞菌细胞膜影响的探索

     作者：田嘉                    

    冷鲜肉是指动物屠宰后将卫生检验合格的胴体迅速冷却到0℃~4℃，并在此温度下对胴体进行加工、贮运和销售的肉类，是欧美发达国家肉制品消费的主要产品类型。我国是猪肉生产和消费大国，其冷鲜产品在加工、流通、销售等过程中存在的主要安全问题是微生物污染。已有研究表明，冷鲜猪肉表面的微生物主要包括嗜冷的革兰氏阴性菌（如假单胞菌属、不动杆菌属、热死环丝菌属、莫拉氏菌属）及兼性厌氧的肠杆菌科。研究某品牌7种冷鲜猪肉产品的菌相组成，发现其优势腐败菌均为假单胞菌。而Li等采用PCR凝胶电泳法分析冷鲜猪肉中微生物菌相组成也得到相同结论。保鲜剂处理是冷鲜肉制品常用的品质维持技术，目前对于冷鲜猪肉中保鲜剂的评价筛选大多局限少数几种。采用抑菌圈和生长曲线分析方法评价了60种化学保鲜剂对冷鲜猪肉中假单胞菌的抑制效果，确定有效的保鲜剂30种。在此基础上，以电导率、碱性磷酸酶活力和菌体显微形态为考察指标，进一步分析筛选出的30种保鲜剂对假单胞菌细胞膜的影响，旨在明确适用于冷鲜猪肉品质维持的高效防腐保鲜剂。

1  材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

    试验菌株由实验室从冷鲜猪肉中分离培养，并经中国典型培养物保藏中心鉴定为草莓假单胞菌。

    假单胞( CFC)选择性培养基、PCA计数琼脂，青岛海博科技公司；酵母粉、蛋白粉，安琪酵母股份有限公司。

    无水乙醇、氯化钠、丙酸、冰乙酸、抗坏血酸、柠檬酸、植酸、乳酸、甲酸、曲酸、苯甲酸、反T烯二酸、双乙酸钠、鞣酸、咖啡酸、乳酸钠、肉桂酸、E-聚赖氨酸、海藻酸钠、苯甲酸钠、水杨酸、丙酸钙、溶菌酶、氢氧化钙、百里酚、茶多酚、壳聚糖、姜黄酮、肉桂油、酒石酸、对羟基苯甲酸乙酯：国药集团化学有限公司。   

 MIR-154低温恒温培养箱：三洋国际；恒温培养箱、鼓风式干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；3100F/C电导率仪、扫描电子显微镜、电子分析天平：奥豪斯有限公司；恒温震荡培养箱：太仓市实验设备厂；低温冷冻离心机：长沙平凡仪器仪表有限公司。

1.2试验方法

1.2.1假单胞菌属菌悬液的制备

    将假单胞菌株在琼脂培养基斜面上划线培养，在30℃培养24 h后，取4~5个形态相同的菌落接种于液体培养基中，继续在30℃培养24 h。培养结束后于3 000 r/min离心10 min，弃上清液，将沉淀菌体用液体培养液稀释至适宜浓度。

1.2.2假单胞菌的电导率测定

    取100 mL浓度为107 CFU/mL菌液于250 mL灭菌三角瓶中，加入终质量浓度为1mg/mL保鲜剂（以不含保鲜剂的菌液作为对照组），置于28℃恒温摇床中在150 r/min转速下振荡培养，分别在0，1，2，3，4，5和6h用电导率仪测定培养液的电导率。

1.2.3假单胞菌的碱性磷酸酶活力测定

    取100 mL浓度为109 CFU/mL的菌液于250 mL灭菌三角瓶中，加入终质量浓度为1mg/mL的保鲜剂，使保鲜剂浓度固定在0.1 g/100 mL（以不含保鲜剂的菌液作为对照组），置于28℃恒温摇床中在150 r/min转速下振荡培养，分别在0，1，2，3，4，5和6h取0.05 mL培养液，在3 500 r/min下离心10 min，采用碱性磷酸酶( AKP)试剂盒测定上清液中AKP活力。

1.2.4扫描电镜观察

    取100 mL浓度为109 CFU/mL的菌液于250 mL灭菌三角瓶中，加入终质量浓度为1 mg/mL的保鲜剂（以不含保鲜剂的菌液作为对照组），置于28℃恒温摇床中在150 r/min转速下振荡培养。24 h后取菌液5 mL，在4℃下以6 500 r/min转速离心4 min，去除上清液。

用pH 7.0的0.1 mol/L磷酸缓冲液清洗沉淀菌体，用2.5%戊二醛固定20 h后弃上清液。固定菌体再次用磷酸缓冲液清洗3次，每次15 min。采用30%，50%，70%，90%及100%乙醇梯度脱水，每次5 min。采用醋酸异戊酯处理两次脱除乙醇，每次5 min。将处理好的菌体样品放于临界点干燥，喷金后在扫描电子显微镜下拍照。

2结果与讨论

2.1  保鲜剂对假单胞菌培养液电导率的影响

    细胞膜受损造成细胞内部电解质外漏，从而使培养液的电导率上升，故可通过培养液中的电导率变化间接反映细胞膜的完整性。培养液中加入保鲜剂后，间隔1 h测定其电导率动态变化，结果如图1所示。保鲜剂能明显影响培养液中的电导率，如茶多酚试验组的电导率明显高于空白对照组，随着培养时间延长，电导率在2—4 h内明显增大，4h后趋于平缓，

同样溶菌酶、乳酸钠、丙酸、苯甲酸、植酸都能明显引起培养液中电解质含量增加，即能有效增大菌体的细胞通透性，破坏细胞膜结构，导致细胞死亡，起到抑菌作用。 研究不同浓度植酸对腐败希瓦氏菌的抑菌机理中发现当植酸浓度为1/2 MIC时，植酸未能使细菌破裂，反而由于植酸金属离子的螯合作用和静电作用导致培养液的电导率值偏小。

2.2保鲜剂对假单胞菌碱性磷酸酶活力的影响

    碱性磷酸酶存在于细胞壁和细胞膜之间，当细胞壁或细胞膜遭到破坏时，该酶会外漏至胞外，故可通过监测培养液中碱性磷酸酶活力反映细胞膜的通透性。培养液中加入保鲜剂后，间隔1h测定其碱性磷酸酶活力的动态变化，结果如图2所示。不同保鲜剂处理后培养液中的碱性磷酸酶活力变化趋势有所差异。肉桂油、咖啡酸、溶菌酶、茶多酚、植酸等保鲜剂添加后，假单胞菌碱性磷酸酶活力都明显升高。]测定添加茶多酚保鲜剂后假单胞菌的碱性磷酸酶含量，在4.5 h后菌液中碱性磷酸酶含量远远高于空白组，与试验结果一致，表明茶多酚对假单胞菌细胞膜有较强的破坏能力。溶菌酶能水解细胞壁中的糖苷键，从而破坏细胞壁结构，导致细胞内容物外漏，细胞死亡。

2.3保鲜剂对假单胞菌显微形态的影响

    通过扫描电镜观察不同保鲜剂处理后假单胞菌显微形态的变化（见图3），电镜图片显示空白对照组的菌体饱满呈长柱状、外部光滑且边缘整齐。不同保鲜剂对假单胞菌的菌体显微形态影响程度不同：甲酸、丙酸、冰乙酸、柠檬酸、E-聚赖氨酸、酒石酸或肉桂油处理后，培养液中未分离得到菌体，表现为对假单胞菌的致死作用；甲酸、曲酸、乳酸、姜黄

酮、百里酚、茶多酚、咖啡酸、壳聚糖、鞣酸、磷酸三钾、肉桂酸或水杨酸处理后，假单胞菌菌体出现断裂、缺口和畸形，表现为致菌体损伤；反丁烯二酸、抗坏血酸、植酸、乳酸钠、双乙酸钠、乳酸链球菌素、丙酸钙、对羟基苯甲酸乙酯、水杨酸、海藻酸钠、溶菌酶或氢氧化钙处理后，假单胞菌菌体性状不规则且表面粗糙，表现为致细胞膜损伤。如图3所示，经壳聚糖保鲜剂处理后，假单胞菌菌体出现弯曲变形，有些部位出现凹陷。研究发现壳聚糖能使菌体细胞沉淀，影响细菌对营养物质的吸收和细菌代谢物的排出，致使其生长代谢紊乱，从而达到抑菌作用。 观察复合保鲜剂处理后腐败希瓦氏菌的超显微结构发现细菌菌体表面出现泡状物，可能是复合保鲜剂中的壳聚糖粘附在细菌表面，从而改变细胞壁和细胞膜性质。

3结论

初步探讨了保鲜剂对冷鲜猪肉中的优势菌属假单胞菌属的抑菌机理，从菌株的扫描电镜照片、碱性磷酸酶含量、电导率变化三个指标研究保鲜剂的抑菌机理。研究发现保鲜剂添加后对假单胞菌的形态、电导率、碱性磷酸酶含量均有影响，说明保鲜剂添加后能够改变假单胞菌细胞膜的通透性、细胞壁的完整性，影响假单胞菌的形体、造成菌体内环境紊乱，从而影响假单胞菌的生长代谢。以电导率、碱性磷酸酶活力和菌体显微形态为考察指标，研究30种保鲜剂对冷鲜猪肉中假单胞菌细胞膜的损伤作用。能显著增加培养液的电导率。而能显著增加培养液的碱性磷酸酶活力。采用扫描电镜观察发现不同保鲜剂对假单胞菌显微形态的影响主要可分为致死亡、菌体损伤和细胞膜损伤三类。研究说明茶多酚、植酸、溶菌酶、壳聚糖等保鲜剂均能有效破坏假单胞菌细胞膜的完整性，用于冷鲜猪肉防腐保鲜可产生较好的抑菌效果。

4摘要

研究多种保鲜剂对特定腐败茵细胞膜的损伤作用，筛选出适用于冷鲜猪肉的高效防腐保鲜剂。分离培养冷鲜猪肉中假单胞菌，考察3()种保鲜剂对其培养液电导率和碱性磷酸酶活力的影响，发现茶多酚、溶菌酶、乳酸钠、丙酸、苯酸钾和植酸能显著增加培养液的电导率，而肉桂油、咖啡酸、溶菌酶、茶多酚和植酸能显著增加培养液的碱性磷酸酶活力。采用扫描电镜观察发现不同保鲜剂对假单胞菌显微形态的影响，其结果大致可分为致死亡、菌体损伤和细胞膜损伤三类。研究结果表明茶多酚、植酸、溶菌酶等保鲜剂均能有效破坏冷鲜猪肉中假单胞菌细胞膜的完整性，造成菌体内环境紊乱，抑制其生长，预期产生良好防腐保鲜作用。