酶法稳定化新鲜米糠研究

作者：郑晓敏

    虽然国内外已经报道各种米糠稳定化方法，例如采用挤压法加热法、化学法、微波法等促使米糠中的脂肪酶和脂肪酸氧化酶失活，但这些方法不仅有设备和操作成本，也通常也导致米糠中天然营养成分及活性物质被破坏而失去其价值。相对而言，米糠的酶稳定化方法由于条件温和并能够最大限度保持其天然成分而值得深入探讨研究。酶法的原理就是利用蛋白酶使米糠中脂肪酶失活而阻止米糠油脂分解酸败。国内外文献报道过应用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶及真菌蛋白酶稳定米糠。但关于蛋白酶对米糠稳定化的系统研究还鲜见报道，因此研究了应用各种蛋白酶稳定化米糠，以期筛选出价廉易得的蛋白酶及其适宜的工艺条件，为工业化酶法稳定新鲜米糠提供科学参考。

 

1  材料与方法

1.1仪器与设备

    万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DHG一9075A电热恒温鼓风干燥机：上海齐欣科学仪器有限公司；脂肪测定仪、凯氏定氮仪：上海嘉定粮油仪器有限公司；TG16G离心机：湖南凯达科学仪器厂；马弗炉：沈阳市节能电炉厂；电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司。

112试验材料与试剂

    新鲜米糠：四川省瑞玉米业有限责任公司；碱性蛋白酶（2.4 AU—A／g）、风味蛋白酶(500 LAPU／g)：诺维信生物技术有限公司；木瓜蛋白酶（50万单位儋）、菠萝蛋白酶（80万单位／g）：北京奥博星生物技术有限公司；，无花果蛋白酶（80万单位／g）、胰蛋白酶（350万单位／g）：西亚试剂；中性蛋白酶（20万单位／g）、脂肪酶（20万单位／g）：江苏锐阳生物科技有限公司；石油醚（沸点30℃~60℃）、磷酸氢二钠、盐酸、无水乙醇、曲拉通、异丙醇、氢氧化钾、酚酞、对硝基苯酚月桂酸，均为分析纯：成都科龙化学试剂厂；蒸馏水。

1.3试验方法

    酶法稳定米糠的原理是向新鲜米糠中加入蛋白酶，与水混合并在一定温度下作用一定时间以使脂肪酶失活，再烘干至一定水分含量，从而降低或灭活脂肪酶活力，达到保鲜米糠的目的。选用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、无花果蛋白酶和胰蛋白酶对米糠稳定化研究。

1.3.1脂肪酶活力的测定方法

1.3.1.1测定原理

    对硝基苯酚月桂酸在脂解酶的作用下水解生成对硝基苯酚和月桂酸，对硝基苯酚在乳化层中呈黄色，在410 nm处有吸收，吸光度越大，脂肪酶活力也越大。

1.3.1.2测定方法

    将待测样品1 mL加入3 mL含0.5%曲拉通的0.1 mol/L磷酸缓冲液( pH 7.4)中，再加入0.4 mL对硝基苯酚月桂酸的异丙醇溶液( 1.67 mg/mL)，将上述溶液置于37℃水浴加热4h，使其充分反应，煮沸5 min终止反应，6 000 r/min离心8 min，取上清液于410 nm处测定吸光度，以吸光度为指标比较脂肪酶活力，空白组为蒸馏水替代待测样品，其它不变。

1.3.2酸价的测定方法

    将储藏的米糠样品，每隔l周取出，按GB/T 5530-2005”植物油脂检验酸值测定法”的标准方法进行测定。

1.3.3其它指标的测定方法

    总蛋白测定参照CB 5009.5-2010，采用凯氏定氮法测定，氮换算蛋白质系数为6.25，水分测定参照GB/T 64353-2006法测定，总脂肪测定参照GB 5009.6-2003，采用索氏提取法，灰分测定参照GB/T 6438-2007法测定。

2结果与讨论

2.1米糠成分分析

通过分析检测，新鲜米糠主要成分见表1。

    

2.2考察蛋白酶对脂肪酶活力的影响

    为筛选合适的蛋白酶，以商品脂肪酶为研究对象，考察各种蛋白酶对脂肪酶的灭活作用，商品脂肪酶和米糠脂肪酶对脂肪的水解机理是相同的，以此来筛选合适的蛋白酶，可大大缩短试验周期，试验结果准确可靠。

    准确量取脂肪酶液( 80 U/mL) 0.5 mL，加入各种蛋白酶液（5 000单位或0.012 AU-A、2.5 LAPU）0.5 mL，在50℃反应4h，再降温至37℃，按照方法1.3.1测定残余脂肪酶活力，对照组为脂肪酶液(80 UlmL) 0.5 mL加0.5 mL蒸馏水，其它不变。

    由试验结果可知，第8为对照组，第1~第7为蛋白酶添加组，添加蛋白酶组吸光度越低，表示对脂肪酶灭活作用越强。碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶对脂肪酶有一定的灭活作用，其中碱性蛋白酶吸光度最低，表示对脂肪酶灭活作用最强，其它蛋白酶对脂肪酶作用非常弱。因碱性蛋白酶对脂肪酶作用最为敏感，故选取碱性蛋白酶考察最佳的灭活条件。

2.2.1考察碱性蛋白酶作用时间对脂肪酶活力的影响

  准确量取脂肪酶液( 80 U/mL) 0.5 mL，加入碱性蛋白酶液( 0.012 AU-A/mL) 0.2 mL，再加入0.3 mL蒸馏水补至1  mL，分别在50℃反应0.5，l，2，3，4和Sh，再降温至37℃，按方法1.3.1测定残余脂肪酶活力，对照组为脂肪酶液( 80 U/mL) 0.5 mL加0.5 mL蒸馏水，其它不变。

    由试验结果可知，随做作用时间的延长，碱性蛋白酶对脂肪酶的灭活作用越强，当作用4h，几乎可将脂肪酶完全灭活。

2.2.2考察碱性蛋白酶用量对脂肪酶活力的影响

    准确量取脂肪酶液( 80 U/mL) 0.5 mL，碱性蛋白酶( 0.012 AU-A/mL)液量分别为0.05，0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mL，加蒸馏水补至1 mL，温度50℃，时反应间4h后，再降温至37℃，按方法1.3.1测定残余脂肪酶活力。

  由此可见，随着碱性蛋白酶用量的增大，吸光度越低，表明碱性蛋白酶对脂肪酶的灭活增强，当添力[量为0.5 mL时抑制达到最大。

2.3不同作用方式对米糠的稳定化研究

2.3.1蛋白酶直接与米糠混合后作用一定时间

    称取300.0 9新鲜米糠（粉碎过筛100目）与iso万单位蛋白酶或7.2 AU-A混合均匀后，在50℃干燥箱中放置4 h，空白组不加蛋白酶，用自封袋密封，在室温下保存。每隔1周索氏提取油脂测定酸值，共计8周。

    由试验结果可知，随着储藏时间的延长，空白组米糠油酸值增加非常迅速，前3周增加速度最快，第3周酸值高达127.1 mg，之后酸值增加趋于平缓，对第1，第2和第3周的酸值进行线性拟合得标准曲线y=25.850x+48.433（R2=0.994 4），斜率25.850即为每周酸值平均增加25.850 mg。碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶酸值增加相对比较平缓，对8周的酸值进行拟合得碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶标准曲线分别i:Jy=11.957x+30.418（R2=0.9831），y=12.33lx+32.361(R2=0.983 1),y=12.305 x+30.954（R2=0.991）。酸值增加速率分别为11.957，12.331和12.305 mg/周，增加速率分别为空白组的0.46倍，0.48倍和0.48倍，空白组存储8周后酸值为154.0 mg，酸值增加了137.3 mg。碱性蛋白酶组的酸值为126.7 mg，酸值增加了110.0 mg，为空白组的80.1%，木瓜蛋白酶组的酸值为129.9 mg，酸值增加了113.2 mg，为空白组的82.4%，菠萝蛋白酶组的酸值为132.7 mg，酸值增加了116.0 mg，为空白组的84.5%。结果表明，碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶对米糠稳定化有一定作用，但这种方式作用并不明显。

2.3.2蛋白酶溶液与米糠混合后作用一定时间

    用蒸馏水配制1 50万单位或7.2 AU-A蛋白酶水溶液150 mL，称取300.0 9新鲜米糠（粉碎过筛100目），将碱性蛋白酶溶液加入米糠中搅拌混合均匀后，在50 cC干燥箱中放置烘干至水分小于8%，用自封袋密封，在室温下保存。每隔1周索氏提取油脂测定酸值，共计8周。

    由试验结果可知，蛋白酶液组的酸值增加相对直接混合更加缓慢，对8周的酸值进行拟合得碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶标准曲线分别为y=2.839 3x+41.911(R2=0.866 9),y=3.540 Sx+49.168(R2=0.991 8),y=3.740 5x+47.243( R2=0.984 2).酸值增加速率分别为2.839 3，3.540 5和3.740 5 mg/周，增加速率分别为空白组的0.11倍，0.14倍和0.14倍，存储8周后碱性蛋白酶组的酸值为67.9 mg，酸值增加了51.2 mg，为空白组的37.3%，木瓜蛋白酶组的酸值为76.3 mg，酸值增加了59.6 mg，为空白组的43.4%，菠萝蛋白酶组的酸值为77.5 mg，酸值增加了60.8 mg，为空白组的44.3%。

    结果表明蛋白酶溶液与米糠混合处理的结果优于蛋白酶直接与米糠混合的结果，与木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶相比，碱性蛋白酶对米糠稳定的效果更佳。

3结论

米糠稳定化处理是有效利用米糠的必要前提。脂肪酶是一种蛋白质，蛋白酶通过水解作用将脂肪酶水解为肽，从而使脂肪酶丧失将脂肪水解为脂肪酸和甘油三酯的能力。同空白组相比，蛋白酶对米糠稳定化有一定作用，蛋白酶直接与米糠混合的效果不及蛋白酶溶液与米糠混合的效果，其中，经碱性蛋白酶溶液处理后的新鲜米糠在室温下储藏效果最佳，存储2个月后，增加的酸值仅为空白组的37.3%。表明蛋白酶对米糠稳定化有一定作用。

4摘  要 

 采用酶法稳定米糠，先以商品源脂肪酶为模拟研究对象，试验碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、无花果蛋白酶和胰蛋白酶对脂肪酶的灭活作用，得到碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶对脂肪酶有较强的灭活作用；并据此研究了蛋白酶对新鲜米糠的稳定化作用。结果是经碱性蛋白酶溶液处理后的新鲜米糠在室温下储藏效果最佳，增加的酸值仅为空白组的37.3%。