作者：郑晓敏
近些年来，紫苏作为新型保健植物油资源，越来越受到重视，其开发利用研究正成为世界热点。紫苏籽蛋白质含量为20%—23%，紫苏饼是紫苏籽提油后的副产品，气味芳香，适口性好，120℃压榨法脱脂后紫苏饼中粗蛋白含量（N×6.25，干基）可达31.22%。目前，紫苏饼大多数只是作为饲料或肥料，有效利用紫苏粕资源，开发紫苏蛋白产品十分必要。超声波具有波动和能量两种属性，对物质有空化效应和机械作用，能显著提高细胞内容物的提取率。
因此，试验以碱溶酸沉法从经超声波处理的高温压榨脱脂紫苏饼中提取蛋白质，观察超声波处理对蛋白质提取率的影响，为用高温压榨脱脂紫苏饼提取蛋白质提供依据。采用超声波辅助碱溶酸沉法，通过在不同超声波功率、超声波时间、料液质量比、碱提温度、碱提时间和碱提pH的条件下提取紫苏蛋白的研究，确定最佳工艺条件，为紫苏蛋白资源的开发利用提供技术依据。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
压榨紫苏饼：吉林沃达食品有限公司；牛血清蛋白、浓盐酸、氢氧化钠、硫酸铜、浓硫酸、四氯化碳、酒石酸钾、甲基红，均为市售分析纯：天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2仪器与设备
AY120型岛津托盘电子分析天平：日本岛津制作所；Sigma l-14K高速冷冻离心机：德国SIGMA公司；IKA All小型冷冻粉碎机：德国IKA集团；101A-3型电热鼓风干燥箱：上海实验仪器厂；HF-2.OB型超声循环提取机：北京弘祥隆生物技术开发有限公司；FW-80万能粉碎机：上海仕元科学器材有限公司；22PC可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；HH-S恒温水浴锅：江苏省金坛市环宇科学仪器厂；SHB-3循环水多用真空泵：广州市深华生物技术
有限公司；PHS-802酸度计：北京华瑞博远科技发展有限公司。
1.3试验方法
1.3.1工艺流程
脱脂紫苏饼→加水搅拌→超声波处理→N aoH溶液调节pH→搅拌→离心分离→蛋白质溶液→盐酸调节至等电点→离心分离→干燥→紫苏蛋白
1.3.2可溶性蛋白质的测定
1.3.2.1双缩脲试剂的配制
取1.5 g硫酸铜和6.0 g酒石酸钾钠溶于500 mL蒸馏水中，加入300 mL的10% NaOH溶液并搅拌，用蒸馏水定容至1000 mL即可，此试剂可长期保存。
1.3.2.2标准曲线的绘制
牛血清白蛋白( BSA)用0.9% NaCl溶液配制成10 mg/mL标准蛋白溶液。取6只10 mL试管并编号，分别加入0，0.2，0.4, 0.6，0.8和1.0 mL牛血清白蛋白标准溶液，用蒸馏水补足至1.0 mL，然后各加入双缩脲试剂4.0 mL，旋涡混合器混匀1 min，在室温下放置30 min，于540 nm处，以蒸馏水作参比，进行比色测定，以牛血清白蛋白质量浓度( mg/mL)为横坐标(X)，吸光度A为纵坐标(Y)绘制浓度一吸光度标准曲线如图1所示。
采用最小二乘法估计标准曲线的线性回归方程为y=0.043 7x+0.066 9．相关系数R=0.998 8。可以看出此标准曲线比较理想，回归方程（即标准曲线方程）具有很好的相关性，可以应用。
1.3.2.3 样液测定
取样品溶液1.0 mL置容量瓶内，加入1.0 mLCCI4，加入双缩脲试剂3.0 mL，旋涡混合器混匀1 min，在室温下放置30 min后，4 000 r/min离心10mm，取上清液于540 nm处，以蒸馏水作参比，进行比色测定，对照标准曲线方程求得样品溶液蛋白质的浓度。以双缩脉法测定的碱提离心后上清液，提取液蛋白质浓度计算紫苏饼蛋白质的提取率，计算方法为：
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1超声时间对紫苏饼蛋白提取率的影响
从图2可知，在超声波处理时间10—30 min范围内，紫苏饼蛋白的提取率随时间增加呈上升趋势，在10—20 min．提取率增加迅速。当超过15 min后，随时间延长，紫苏饼蛋白提取率迅速下降。可能是由于超声提取时间过长，导致整个反应系统内部温度逐渐上升，最终导致一部分蛋白发生变性。图2表明，在超声波处理15 min时，蛋白提取率达到26.8%，故超声波处理时间选择15 min。
2.1.2料液质量比对紫苏饼蛋白提取率的影响
在超声波功率180 W，超声时间15 min，碱提温度40℃，碱提pH 9的条件下，研究不同料液质量比对紫苏饼蛋白提取率的影响，由图3试验结果可知，随着料液质量比的增加，紫苏饼蛋白提取率快速上升，在料液质量比1: 20时达到最高。其原因是对紫苏饼中蛋白质的浸提已趋于平衡，即便增大料液质量比也不可能提高产品蛋白质含量。因此，选取料液质量
比1：18—1：22作为制备紫苏分离蛋白正交试验的水平。
2．1.3碱提温度对紫苏饼蛋白提取率的影响
由图4可以看出，25℃—40 ℃之间，随着温度提高紫苏饼蛋白质提取率提高。40℃以后提取率稍有下降，紫苏饼蛋白提取率呈急剧下降趋势。原因是由于随着温度的升高，蛋白质在45℃—60℃易受热变性，使蛋白质提取率下降，蛋白质变性影响产品的功能性，而且黏度增大，分离困难，净能耗也增加，故本工艺的温度控制在40℃左右为佳。
2．1.4碱提pH对紫苏饼蛋白提取率的影响
由图5可见，随碱溶pH的增大，产品蛋白质提取率呈先上升后下降趋势。随着pH的增加，蛋白质带的电荷增多，蛋白质一水的相互作用增大，蛋白质一蛋白质之司的作用减小。当pH继续升高到10以上时，少量蛋白质可能发生极端变性，蛋白质含量略有下降。因此，
选取pH 8—10作为制备紫苏饼蛋白正交试验的水平。
2.2响应面设计结果与分析
基于单因素试验设计，对优化工艺条件进行了一系列的试验，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理。利用Design-Expert 8.0.6进行响应面法( Response Surface Methodology( RSM))优化影响紫苏饼粕蛋白提取率的四个主要因素：超声波时间（x1）、料液质量比( X2)、碱提温度(X3)、碱提pH进行优化组合。考察目标为提取率，试验因素水平安排以及根据以上水平编码设计试验表格并检测响应值，结果见表1。
对表1数据进行二次多元回归拟合，可求出影响因素的一次效应、二次效应以及交互效应的关联方程并可绘制出响应面图。该模型通过二阶经验模型对变量的响应行为进行表征，即：
式中，Y-响应值；β0、,βi、,βii一表示偏移项、线性偏移、二阶偏移系数；卢，，一交互效应系数；xi各因素的编码值。对表1试验数据进行多元回归拟合得到感官评分(Y)对编码自变量xl、X2和X3的二次多项式回归方程。
Y=2 8.60- 1.3 0xl-0.63x2-0.1 3x3+0.5 9x4-0.15xlx2+0.15x1X 3+0.063x1X4-0.5 0X 2X3- 1.5 0x2x4+0.3 9X 3X4- 3.21x12_3.43x22_3.02x32-2.OOx42
表2结果表明，模型是显著的(P<0.05)，R2=0.705 7．R2Adj=0.411 3，R2pred=-0.695 4，模型变异系数为9.99%，精密度为5.090，说明模型准确度和精密度都较高，用该模型进行分析和预测是合理的。
由表2可知，一次项x4显著，由F值和Prob>F可知，单因素的影响顺序为X1>X4>X2>X3．超声波时间>碱提pH>料液质量比>碱提温度；二次项x12，X22，x32高度显著。
2.3 回应曲面分析
响应面曲面的坡度可反映该因素对蛋白质提取率影响的强弱程度。响应曲面相对平缓，说明其可容忍处理条件的影响。由图6 (a)得，在超声波时间x1与料液x交互作用响应曲面中，曲面坡度沿X2轴方向变化的趋势明显高于x1，说明因素料液质量比对紫苏饼粕蛋白质提取率的变化比超声波作用时间的变化敏感。图6(b)中曲面坡度沿轴x1方向变化显著，说明在超声波时间和碱提温度的相互作用中，超声波时间对紫苏饼粕蛋白质的提取率的变化比碱提温度变化敏感。由图6 (c)可以看出碱提pH的曲面坡度变化明显高于超声波时间方向的变化，说明碱提pH对响应值的影响要远远大于超声波时间的影响。图6(d)中的曲面坡度变化趋势显示其沿X2方向变化的趋势要相对高于x3方向的变化，料液质量比对紫苏蛋白质提取率的变化比碱提温度的变化敏感。图6 (e)中的曲面坡度变化趋势显示其沿x4方向变化的趋势要相对高于X2方向的变化，碱提pH对紫苏饼粕蛋白质提取率的变化比料液质量比变化敏感。图6 (f)中的曲面坡度变化趋势显示其沿x4方向变化的趋势要相对高于x3方向的变化，碱提pH对紫苏饼粕蛋白质提取率的变化比碱提温度的变化敏感。
2.4最佳条件的确定
为了确定最佳工艺配方条件，对回归方程取一阶偏导数等于零解方程组得x1=-0.197 66，X2=-0.129 39，X3=-0.003 27和X4=0.192 588，此时Y=28.826 26%。
即紫苏饼粕蛋白提取的最佳工艺参数为超声波时间14.407 03 min、料液质量比为1：17.741 23、碱提温度为39.967 25℃、碱提pH为9.592 588。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用最佳提取工艺条件进行紫苏饼粕蛋白粉脱臭加工，考虑到实际操作的便利，将工艺参数修正为：超声波时间15 min、料液质量比为1：18、碱提温度为40℃、碱提pH为9.6。
3结论
在单因素试验的基础上，利用响应面法对超声波辅助提取紫苏饼蛋白提取效果有影响的各个因素，既省时也可同时比较分析各因素之间的交互作用，保证了试验的精确性。并通过Box-Behnken中心组合试验，建立了紫苏饼粕蛋白质提取相互作用的二阶多项式回归模型。对回归模型进行统计分析，获得最优化工艺。超声辅助提取紫苏饼粕蛋白质的最佳工艺条件为：超声波时间15 min、料液质量比1：18、碱提温度40℃、碱提pH 9.6；在此条件下，紫苏饼粕蛋白质提取率为28.826 26%，与理论值基本相符。因此，利用响应面分析方法对超声波辅助提取紫苏饼蛋白工艺进行优化，可以获得最优的工艺参数，这为进一步试验研究奠定了基础。
4摘要
以120℃压榨紫苏饼为原料，采用超声波技术辅助提取紫苏饼蛋白质，考察了超声时间、料液质量比、碱提温度和碱液pH对紫苏饼蛋白质提取率的影响，并以响应曲面法优化工艺条件；结果表明，超声波辅助提取紫苏饼蛋白质最佳提取工艺条件为：超声时间15 min、料液质量比1：18、碱提温度40℃、碱提pH 10，在此条件下，紫苏饼蛋白质一次提取率为28.826 26%。
