作者：张毅
花色苷是花青素与糖类物质以糖苷键结合而成的一类化合物，为蔬菜、水果等食物中所含的天然色素，属植物化学成分中的黄酮类化合物，具有抗氧化[2]、抗炎症[3]、抗肿瘤[4]、抗动脉粥样硬化[5]等优异生物活性，已被广泛用于食品、保健品、化妆品、医药等行业。紫扁豆中的色素主要为花色苷，人们可经日常食用途径摄入而起到一定的保健功能。大孔树脂因其理化性质稳定、分离性能优良、溶剂用量少等优点而应用于天然植物活性成分的分离纯化[6-7]，利用大孔吸附树脂纯化天然植物花色苷多见于紫甘薯[8]、紫甘蓝[9]、蓝莓果等[10] 叫紫红色果蔬。目前，关于紫扁豆花色苷纯化方的研究鲜见报道。试验以紫扁豆为原料，对紫扁豆花色苷纯化树脂的筛选及树脂吸 附-解吸性质进行研究，探讨DM-28树脂分离纯化紫扁豆花色苷的工艺条件，旨在为人们深入了解紫扁豆的食用价值或开发利用提供理论依据和科学参考。
1 材料与方法
1.1试验材料
紫扁豆：市售，干燥粉碎后备用。 试剂：无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、氯化钾、醋
酸钠：均为分析纯试剂；树脂：AB-8，X—5, DM- 20，DM-21，DM-21D，DM-28，DM-2:山东鲁抗立 科药业有限公司。
1.2仪器与设备
Q-350B3型高速粉碎机：上海冰都电器有限公 司；GPX-9248A型干燥箱：上海跃进医疗器械有限 公司；HH-4数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公 司；FA2104V型电子天平：上海青浦仪器有限公司； V-5600型可见分光光度计：上海元吸仪器有限公司： SHZ-D型循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任 公司；TDL-5-A型低速大容量离心机：上海安亭科学 仪器厂。
2试验方法
2.1 紫扁豆花色苷粗提物的制备流程
紫扁豆->烘干->粉碎->醇提->抽滤->旋转蒸发->定容
2.2花色苷含量测定
2.2.1 缓冲液的配制
pH 1.0缓冲液：称取1.49 g KC1定容100 mL，1.7 mL HCI定容100 mL．KC1与HCI体积比25：67配置。pH 4.5缓冲液：称取2.72 g NaAc．3H20定容100 mL，HCI调pH。
2.2.2紫扁豆花色苷最大吸收波长的确定
取一定量紫扁豆提取液用酸性乙醇溶液稀释至一定体积，使其吸光度在一定范围内，在400—600 nm波长范围内扫描，绘制吸收光谱图曲线。
2.2.3花色苷含量的测定
采用pH示差法[11-12]，移取2 mL待测液分别用pH1.0和pH 4.5的缓冲液定容到10 mL，放置一定时间平衡后[13] ，波长538 nm和700 nm处测定吸光度。
Mw-矢车菊花素-3-葡萄糖苷的相对分子质量449.2：
2.3树脂筛选
2.3.1树脂预处理
将大孔树脂AB-8，DM-21，DM-28，DM-21D,DM-2，DM-20和X-5用95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入柱中。用3倍柱床体积( BV) 95%乙醇洗脱，洗至洗脱液透明无醇味且蒸干后无残渣（或极少残渣）。再依次用2 BV 5%NaOH溶液浸泡后蒸馏水洗至pH为中性，2 BV的4%盐酸浸泡并以蒸馏水洗脱至pH中性，备用。
2.3.2不同树脂静态吸附和解吸性能比较
分别称取已活化处理的七种树脂0.5 g于250 mL锥形瓶中，加入pH 3质量浓度为0.171 9 mg/mL花色苷粗提液50 mL，盖紧瓶塞。室温(15 0C)静置24 h吸附饱和，吸取上清液测定其吸光度A1，计算其静态吸附率。将吸饱树脂用蒸馏水冲洗后抽滤去大部分水分，各称取0.5 g置于250 mL锥形瓶中，加入50 mL pH 3.0的80%乙醇溶液解吸24 h，吸取上清液测定其吸光度
A2，计算其静态解吸率。
吸附率=（初始花色苷含量-吸附后花色苷含量）／初始花色苷含量×100% (2)
解吸率=解吸液花色苷含量／吸附花色苷含量×100% (3)
2.4树脂静态吸附-解吸试验
2.4.1树脂静态吸附试验
称取已处理的DM-28树脂0.5 g于250 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL不同浓度和pH的色素稀释液，在不同温度，时间下进行吸附，分别考察样液浓度，样液pH，时间和温度对吸附率的影响。
2.4.2 DM-28树脂静态吸附条件优化
选择对大乳树脂吸附效果较好的3个因素安排L9(34)正交试验，以吸附率为指标，对DM-28树脂吸附紫扁豆花色苷的条件进一步优化。正交试验设计因素水平表见表1。
2.4.3树脂静态解吸试验
过滤最佳吸附条件下吸附饱和的树脂，用50 mL不同乙醇浓度和不同pH的乙醇溶液解吸，分别考察解吸液浓度和解吸液pH对解吸率的影响。
2.5树脂动态吸附-解吸条件研究
取一定量湿树脂装柱，用不同的吸附流速，样液浓度上样，每3 mL收集流出液并测定其吸光度，当达到泄漏点时，停止吸附进样，考察不同上样流速，样液浓度对单位树脂色素饱和吸附量和上样时间的影响。吸附饱和的树脂柱用2 BV/h的蒸馏水洗去残留的糖分。用不同浓度，pH的洗脱剂在不同洗脱流速下洗脱，每3 mL收集色素洗脱液，确定其最适宜的洗脱剂浓度、洗脱剂pH和洗脱流速。
2.6色价的测定
称取适量干燥的紫扁豆花色苷，用pH 3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液稀释定容至100 mL，用1 cm比色皿以缓冲溶液作空白，在最大吸收波长处测定吸光度。
式中：A-最大吸收波长处吸光度；m-称取样品的质量，g。
1 3结果与分析
1 3.1紫扁豆花色苷提取液光谱扫描图谱
紫扁豆花色苷提取液经紫外可见分光光度计扫描后的光谱图见图1。由图1可知紫扁豆花色苷的最大吸收波长为538 nm。
3.2最佳树脂的筛选
由表2可知，七种大孔树脂对紫扁豆花色苷都有一定的吸附能力，其中DM-28的吸附率和解吸率均高于其它六种大孔树脂，综合考虑吸附和解吸两方面的因素，确定DM-28为试验的最佳树脂。
3.3树脂静态吸附性能试验
3.3.1 pH、浓度、温度和时间对吸附的影响
国内学者王京亭[14] 认为，在不同的pH条件下，花色苷主要存在氧鎓盐，醌式碱，甲醇假碱和查尔酮四种结构，且四种结构随pH变化呈现不同的平衡状 态。强酸和弱酸溶液中分别以红色的氧翁盐阳离子和紫红色脱水碱基阴离子存在，中性溶液中以无色假碱结构为主，碱性溶液中主要为蓝色醌式碱。试验中pH1.0～5.0对花色苷吸附的影响结果如图2 (a)所示，pH在4.0之前吸附率先升高后稍有下降，却在pH为5.0时吸附率达最大，其原因可能是随着溶液酸性的减弱，紫扁豆花色苷结构更趋于转化为脱质子化的醌型碱，且结构变化后使溶液中花色苷在固定波长下的吸收有所变小，致使紫扁豆花色苷的吸光度在吸附前后的差值增大，使pH 5.0时在表观上吸附率达到了最大值。考虑到溶液花色苷的稳定性，确定溶液pH 3.0为较适合吸附条件。
由图2 (b)不同溶液质量浓度对吸附效果的影响可知，随着稀释倍数的增大，吸附率逐渐下降，即在溶液浓度最大时吸附效果最好，所以确定0.554 4 mg/mL的原液为溶液吸附质量浓度。
不同温度下DM-28对紫扁豆花色苷吸附效果如图2 (c)所示，在相对较低的温度下，温度上升有利于树脂对花色苷的吸附，继续升温其吸附率略有下降，原因可能是温度升高可加快分子运动而使分子相对难以在树脂表面吸附，且温度升高可能对花色苷的稳定性造成-的影响，因此，确定吸附温度40℃较好。
吸附时间对吸附率的影响如图2 (d)所示，随着时间的延长紫扁豆花色苷吸附率逐渐增大，在180 min后吸附率变化不大，即在此时树脂已基本吸附饱和，所以确定吸附时间为180 min。
3.3.2紫扁豆花色苷静态吸附正交试验结果
由表3正交试验结果可知，各因素对紫扁豆花色苷吸附影响程度依次为吸附pH>吸附时间>吸附温度，最佳组合为A3B3C2，吸附率达89.92%,但与极差分析所得最优水平组合A2B3C2不符，因此对A3B3C2和A2B3C2进行验证试验。表4结果显示各因素的水平之间均无显著性差异。
3.3.3优化条件的验证及重现性试验
表5和表6结果表明，A3B3C2为最佳吸附条件，即吸附温度50℃，样液pH 4.0，时间180 min;按A3B3C2进行平行实验，结果显示试验结果的变异系数仅为0.91%，表明重现性好，所得最优条件组合正确可行。
3.4树脂静态解吸性能实验
酸性条件下乙醇溶液pH对花色苷解吸效果如图3 (a)所示，随pH升高，解吸率逐渐减小，pH为1.0时解吸效果最佳。这可能是在pH 1.0的溶液中紫扁豆花色苷主要以极性较大的氧翁盐阳离子形式存在，非极性DM-28树脂对其吸附相对较弱，因此酸性较强（极性较大）的乙醇溶液相对更易将花色苷洗脱。故在此条件下，选用pH 1.0的乙醇溶液为静态解吸的最适pH。由图3(b)可知，乙醇体积分数在60%和80%时所得解吸率较高，通过可见分光光度计测定两个体积分数解吸液透光率发现，80%乙醇洗脱的解吸液较混浊，透光率较低，导致吸光度明显偏高。可能因为80%乙醇洗脱能力较强，吸附在树脂上的醇溶性杂质被大量洗脱，所测吸光度偏高在表观上具有高解吸率，鉴于此，选定60%乙醇为最佳的解吸体积分数。
3.5动态吸附与解吸性能
3.5.1动态下上样质量浓度和上样流速对吸附率的影响
上样质量浓度是影响树脂吸附性能的重要因素之一。树脂吸附容量一般以较低浓度进行较为有利。如果原液浓度偏高，则泄漏点早，处理量小，树脂使用周期短，树脂再生次数增多；如果原液质量浓度偏低，工作效率降低。由图4可知，选择稀释倍数为2，即质量浓度0.277 2 mg/mL为最佳质量浓度。由表7可知，流速在1.0～3.0 mL/min时吸附量随流速的增大而下降，流速过大，使树脂的吸附量下降，提早泄漏；流速较小时，虽然树脂吸附量较多，但会造成生产周期长，生产效率低，因此选择上样流速为1.5 mL/min。
3.5.2动态下洗脱液pH、乙醇体积分数和洗脱流速对解吸率的影响
静态吸附试验可知，在pH 5.0时，紫扁豆花色苷可能转化为醌型碱结构使其稳定性下降，并导致其在固定波长下的吸光度变小等不利影响，为此，选择使花色苷结构保持稳定的pH 1.0～3.0为解吸条件进行试验。图5 (a)结果表明，随pH的增加解吸率呈下降趋势，在pH 1.0时解吸最好，结果与静态洗脱相一致。由图5 (b)可以看出，pH1.0的不同体积分数乙醇溶液对DM-28树脂上花色苷的解吸能力呈先升后降的趋势，以60%乙醇洗脱时，解吸率最大，且60%乙醇洗脱时，洗脱速度较快，能将树脂吸附的花色苷基本洗脱，所得洗脱液清澈透明，故60%乙醇溶液为合适的洗脱剂。图5 (c)显示洗脱流速对树脂动态解吸性能的影响，动态下极性较大的60% pH 1.0的乙醇溶液对吸附较弱但极性相对较大的花色苷氧鎓阳离子具有较强的洗脱能力，随着洗脱流速的增大，解吸率逐渐增大，且在流速达到3 mL/min时解吸率急剧上升，但此时观察到洗脱液浑浊，可能是流速过大使一些吸附于树脂上的非花色苷类物质被洗脱下来。从纯度和效率综合考虑，选择洗脱流速为2.5 mL/min。
3.6色价的测定结果
紫扁豆花色苷纯化前色价为2.1，纯化后的色价为14.06，是纯化前的6.7倍，DM-28树脂对紫扁豆花色苷具有较好的纯化效果。
4结论
从七种大孔树脂中筛选出DM-28型大孔树脂是纯化紫扁豆花色苷较适合的树脂类型。通过单因素和正交试验，优选出DM-28型大孔树脂的最佳静态吸附工艺条件为：样液质量浓度为0.554 4 mg/mL，样液pH 4.0，温度50℃，时间180 min，在此条件下，吸附率可以达到89.92%；并在pH 1.0，60%乙醇溶液中解吸效果最好。DM-28型大孔树脂对紫扁豆花色苷动态吸附-解吸最适工艺条件为：上样液流速1.5 mL/min，上样液质量浓度0.277 2 mg/mL，洗脱剂体积分数60%，洗脱流速2.5 mL/min，洗脱剂pH 1.0。经过大孔树脂的富集，可以在一定程度上将提取液中的糖类及无机盐类除去，紫扁豆花色苷纯化后的色价为14.06，是纯化前的6.7倍。说明DM-28大孔树脂对花色苷类化合物有较好的富集纯化效果，具有一定的应用价值。
摘 要
比较了七种大孔树脂对紫扁豆花色苷的静态吸附-解吸特性，研究了DM-28大孔树脂对紫扁豆花色苷静态、动态吸附-解吸工艺条件。结果表明：DM-28大孔树脂为纯化紫扁豆花色苷的最佳树脂；静态吸附-解吸最佳条件为：样液质量浓度0.554 4 mg/mL，样液pH 4.0，吸附温度40 0C，吸附时间180 min,在pH 1.0, 60%乙醇溶液条件下 解吸：动态吸附一解吸最适工艺条件为：上样质量浓度0.277 2 mg/mL、上样流速1.5 mL/min，以流速2.5 mL/min, pH 1.0的600A乙醇洗脱。纯化后花色苷色价为14.06，为纯化前的6.7倍。
