午血液营养丰富，血红蛋占全血蛋白质的80%;血红蛋白由血红素和珠蛋白结合而成，每1血红蛋白分子由4分子珠蛋白和4分子亚铁血红素组成，珠蛋白约占96%，血红素占4%。经过现代生物酶解技术，血红蛋白在被降解成多肽的同时，释放出血红素或血红素肽。血红素或血红素肽则是一种优良的补铁剂。血红素可制成补血营养剂用于治疗缺铁性贫血引起的各种疾病，与硫酸亚铁补铁剂相比，血红素铁的生物利用率高出23%，红素多肽还可制成氨基酸口服液、注射液及复合液用于补充强化各种氨基酸。但由于血红蛋白分子结构致密，蛋白酶具有底物专一性，使酶解不够彻底且酶解过程中会产生疏水性氨基酸含量较高的苦味小肽等问题，限制了血红素多肽的推广和应用。因此，为获得苦味值较低的富血红素多肽产物，试验筛选了适于生产血红素多肽的用酶，对血红蛋白进行分步酶解，最终得到最佳酶解方法和工艺条件。为血红素多肽产品的开发与生产奠定一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1材料、仪器与设备
牛血红蛋白粗制品，新鲜牛血抗凝处理，纱布过滤后，3 000 r/min离心15 min，弃去上清液，收集下层红细胞，用生理盐水洗涤2-3次，超声波细胞破碎后冷冻干燥备用；木瓜蛋白酶（76 900 U/g蛋白质）：上海瑞永生物科技有限公司；中性蛋白酶( 25 600 Ulg)和碱性蛋白酶（46 200 U/g蛋白质）：北京房山酶制剂厂；风味蛋白酶（22 400 U/g蛋白质）：上海实验试剂有限公司；氯化血红素对照品：天津福德士科技有限公司；喹琳：天津市化学试剂一厂；其他试剂均为分析纯。
DK-8D数显恒温水浴锅：金坛市富华仪器有限公司；Neofuge-15R台式高速冷冻离心机：力康发展有限公司；凯氏定氮装置：泉州市万达实验仪器设备；BS2000S电子分析天平：丹佛仪器（北京）有限公司；FDU-1200冷冻干燥机：上海爱朗仪器有限公司；UVmini-1240紫外可见分光光度计：岛津国际贸易（上海）有限公司；PHS-3C型pH计：上海精密仪器仪表有限公司。
1.2试验方法
1.2.1工艺流程
血红蛋白粗制品一加酶搅拌（控制反应条件）一沸水浴灭酶( 15 min)_离心(4 200xg，20 min)一酶解液一冷冻干燥一血红蛋白多肽。
1.2.2酶活测定
福林酚法。
1.2.3氨基态氮测定
甲醛滴定法。
1.2.4血红素测定
紫外分光光度法。
1.2.5苦味值评价
称取哇琳0.1 9溶于50 mL 5%乙醇溶液中，取5 mL 该溶液用蒸馏水稀释到100 mL，得到1.0×10。4 g/mL哇琳溶液，再进一步稀释成5×10-5，2.5×10。5，lxl0。6和5×10。7 g/mL质量浓度的哇琳溶液，其苦味值分别定义为10，5，2.5，l和0.5分，选6位具有风味评价经验人员品尝多肽溶液的苦味与不同浓度哇琳溶液比较，从而确定多肽溶液的苦味。
1.2.6水解度测定
水解度DH=酶解液中氨基态氮／酶解液中总氮含量x 100% (1)
1.2.7总氮测定
凯氏定氮法。
1.3正交试验设计
1.3.1单酶酶解
采用L，6(45)正交表‘61研究酶种类、底物浓度、酶浓度和水解时间4种因素对水解度、血红素、苦味值等指标的影响。试验因素水平表见表l。
1.3.2分步酶解
在 
正交试验的基础上，选择合适用酶，确定用酶浓度，在酶的最适水解温度及pH下进行分步酶解，并采用Lg(34)考察底物质量分数、水解时间比例、酶添加量比例和pH对各指标的影响，优化最佳酶解参数。试验因素水平表见表2。
2.1单酶酶解各因素对指标的影响结果分析
单酶酶解正交试验设计及结果参见表3。
2.1.1水解度分析
由表4方差分析结果显示：酶种类和水解时间水解度指标影响显著，各因素影响程度大小依次为酶种类、水解时间、底物浓度和酶浓度。
由效应曲线图1可以看出，酶种类对水解度影响的优劣顺序为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶。底物浓度对水解度影响的优劣顺序为8%，4%，2%和60-/0；酶浓度对酶解液中水解度含量影响的优劣顺序为6 000，2 000，4 000和8 000 U/g;水解时间优劣顺序为7，9，5和3h。
因此对于水解度这一指标来说最优组合是：中性蛋白酶，底物浓度8%，酶浓度6 000 U/g，水解时间7h。
2.1.2血红素含量分析
由表5方差分析结果显示，酶的种类对水解液中血红素含量的影响达到显著水平，其它因素的影响不显著，各因素影响程度的大小排列为酶种类、水解时间、酶浓度和底物浓度。
由效应曲线图2可以看出，酶种类对水解液中血红素含量影响的优劣顺序为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶；底物浓度对血红素含量影响的优劣顺序为60-/0，2%，8%和40-/0；酶浓度对酶解液中血红素含量影响的优劣顺序4 000，8 000，2 000和6 000 U/g水解时间优劣顺序为3，5，9和7h。
因此对于血红素这一指标来说，最优组合是：碱性蛋白酶，底物浓度60-，酶浓度4 000 U/g，水解时间3h。
2.1.3苦味值分析
由方差分析表6结果显示：酶种类和水解时间对酶解液水解度影响显著，各因素影响程度大小依次为酶种类、水解时间、底物浓度和酶浓度。
由效应曲线图3可以看出，酶种类对苦味值的影响优劣顺序为风味蛋白酶、碱性蛋酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶；底物浓度对苦味值的影响的优劣顺序为2%，4%，6%和8%;酶浓度对苦味值影响的优劣顺序为6 000，2 000，4 000和8 000 U/g。水解时间优劣顺序为5，3，7和9 h。
因此对于苦味值这一指标来说最优组合是：风蛋白酶，底物浓度2 0-10，酶浓度6 000 U/g，水解时5h。
2.2分步酶解用酶的确定
以血红素含量为指标，碱性蛋白酶最好，这与万根等的研究结果一致。原因可能是血红素在碱条件溶解性更好，不易相互聚集沉淀，以水解度为标，中性蛋白酶最好，这与瞿桂香等的研究结果致。中性蛋白酶是最佳酶，可能与它的专一性不强关，可以推测，从蛋白质上水解下来的肽段可以继：被中性蛋白酶水解，形成分子量较小的多肽和氨：酸。以苦味值为指标，风味蛋白酶最好。风味蛋酶水解度不高，但苦味值较低，可能是因为风味蛋酶为外切酶，作用于肽链末端的肽键，酶解产物主：为氨基酸和大分子肽，可减少水解液苦味。由于j验目的在于苦味值低的富血红素多肽，因此选用碱一蛋白酶与风味蛋白酶作为分步酶解用酶。由酶浓度j血红素和苦味值的影响优劣顺序，以及为底物提供，够的酶解用酶，确定酶浓度为6 000 U/g。
2.3分步酶解各因素对指标的影响结果分析
分步酶解正交试验设计及结果参见表7。
2.3.1水解度分析
由表8方差分析图可以看出，各因素对水解度的影响均不显著，这可能是因素之间有互作效应，所以误差平方和较大，从而使因素的效应达不到显著水平。相对来说优劣顺序为水解时间、底物浓度、酶添加量比例和水解时间比例。
由效应曲线图4可以看出，水解时间对水解度影响优劣顺序为10，8和6h，底物浓度对水解度影响的优劣顺序为60-/0，8%和40-/0，酶添加量比例优劣顺序为5:5，7:3和9:1，水解时间比例对血红素含量影响的优劣顺序为1：2，2:1和1:1。
因此对于水解度这一指标来说最优组合是：水解时间10 h，底物浓度6%，酶添加量比例5:5，水解时间比例1：2。
2.3.2血红素含量分析
由方差分析表9可以看出，各因素对血红素指标无显著影响。可能是因素之间有互作效应，所以误差平方和较大，从而使因素的效应达不到显著水平。相对来说优劣顺序为：酶添加量比例、水解时间、底物浓度和水解时间比例。
由效应曲线图5可以看出，酶添加量比例优劣顺序为9:1，5：5和7:3，水解时间对酶解液血红素含量影响优劣顺序为10，6和8h，底物浓度对血红素含量影响的优劣顺序为6%，40-/0和8%，水解时间比例对血红素含量影响的优劣顺序为1：1，2:1和1:2。
因此对于血红素这一指标来说最优组合是：水解时间10 h，底物浓度6%，酶添加量比例9:1，水解时间比例1：1。
2.3.3苦味值分析
由方差分析表10可以看出，底物浓度，酶添加量比例，水解时间对苦味值影响显著，相对来说优劣顺序为底物浓度，水解时间，酶添加量比例，水解时间比例。
由效应曲线图6可以看出，水解时间对苦味值影响优劣顺序为10，8和6h，底物浓度对水解度影响的优劣顺序为60-/0，8%和40-/0，酶添加量比例优劣顺序为5:5，7:3和9:1，水解时间比例对苦味值影响的优劣顺序为1：1，2：1和1：2。
因此对于苦味值这一指标来说最优组合是：水解时间10 h，底物浓度6%，酶添加量比例5：5，水解时间比例1：1。
2.3.4单酶酶解与分步酶解各指标对比
由图7分析可知分步酶解的氨基氮含量，水解度，血红素含量，明显高于单酶酶解，而苦味值相对较低，可以判断分步酶解效果明显优于单酶酶解效果。
3讨论
底物浓度是分步酶解中最重要的因素，对水解度和苦味值指标影响很大。通过各指标分析可知底物浓度6%时最宜，原因可能是4%时底物浓度太低，没有足够的底物与酶形成中间复合物，而底物在8%时，由于浓度较大，血红蛋白形成稠状的物料，流动性差，不利酶的连续作用，因此其水解效果比底物质量分数为6%时较差。影响分步酶解的另一重要因素是时间，由各指标综合分析，10 h酶解效果最佳，可以使蛋白酶解更加彻底。酶添加量比例5:5为宜，水解时间比例为1：1，因为对各指标的影响较小，可以根据生产情况而定。
综合各指标分析，分步酶解优于单酶酶解，原因可能是碱性蛋白酶为内切酶，风味蛋白酶为外切酶，将两种酶相结合，在各自适宜的条件下进行酶解作用，使血红蛋白酶解更加彻底。同时，风味蛋白酶作用于肽链末端的肽键，酶解产物主要为氨基酸和大分子肽，减少了碱性蛋白酶水解液产生的腥味和苦味。
4结论
以水解度为指标，中性蛋白酶最好，以血红素为指标碱性蛋白酶最好，以苦味值为指标，风味蛋白酶最好；综合分析影响分步酶解的因素优劣顺序为：底物浓度>酶解时间>酶添加量比例>酶解时间比例；酶解效果优劣顺序为：分步酶解法>单酶酶解法；分步酶解最佳条件为：底物浓度6%，酶解时间10 h，酶添加量比例5:5．酶解时间比例1：1，在此条件下可制备出苦味值较低血红素含量较高的多肽产物。
5摘要
为制备低苦味血红素多肽产物，以牛血红蛋白为原料，在木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶的最适i湿度13LpH下，通过L，。(4')正交试验进行单酶酶解，筛选出分步酶解用酶，并采用Lg(34)正交试验考察了分步酶解过程中底物质量分数、酶添加量比例、水解时间、水解时间比例等因素对水解度、苦味值、血红素含量等指标的影响。结果表明：分步酶解法酶解效果优于单酶酶解法；采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶进行分步酶解，条件在底物质量分数60A，酶添加量比例5:5，酶解时间10 h，酶解时间比例1：1时可获得苦味值较低的富血红素多肽产物。
