作者：曹健国
类肝素是指天然的、合成的和半合成的与肝素有类似作用的物质。类肝素能够与数百种蛋白质相结合，从而影响蛋白质的空间构象、寿命和生物活性；类肝素还可以和胞外基质中的多种蛋白质相结合，控制他们的分布、转移和信息传递。因此，类肝素是一种重要的信息分子，能够对主体细胞的行为如细胞的增殖、分化、结合起调控作用，并参与外来细胞的识别和控制过程。舒洛地特、冠心舒等类肝素药物因安全有效性得到患者的认同。
肝素是从猪小肠黏膜中提取的黏多糖物质，具有显著地抗凝血和防止血栓形成的作用，在临床中常作为抗凝血药物。在利用树脂吸附法提取肝素钠的传统工艺中，由于大量的蛋白被树脂吸附，在树脂洗脱条件单一的情况下，造成大量类肝素残留在废蛋白中，其中主要包括硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和少量残留肝素，从而导致资源浪费。笔者提出了一种从废蛋白中提取类肝素的工艺，并确定了其最佳的工艺条件。
1材料与方法
1.1 材料与仪器
肝素钠标准品，357 U/mL，U．S．PharmacopeialConvention生产；绵羊血浆，山东苍山向明生化助剂厂生产；FPA98 Cl树脂：Rohm and Haas Company生产；2709酶，北京东华强盛生物技术有限公司生产；双氧水，无锡市晶科化工有限公司；乙醇等其他试剂，均为分析纯，市售。
双层玻璃反应釜：S212B型，杭州惠创仪器设备有限公司生产；磁力搅拌油浴锅：DF -Ⅱ型，常州澳华仪器有限公司生产；紫外可见分光光度计：752N型，上海仪电分析仪器有限公司生产；手持式pH计：PHB_4型，上海仪电科学仪器股份有限公司生产；真空干燥箱：DZF -6021型，上海精宏实验设备有限公司生产。
1.2 实验方法
1.2.1 类肝素提取工艺
类肝素提取工艺流程如图1所示。
首先采用2709碱性蛋白酶进行酶解，酶解时蛋白与水体积比约为1：2，加入2709酶的酶量为1g/L，反应温度设置为53℃，pH为8.5左右，盐浓度为0.6 mol/L左右，保温时间为3h。保温结束后升温至80℃，灭酶活反应15 min。吸附阶段首先加入0.5 g/L的FPA98 Cl树脂进行吸附，吸附条件为58℃，盐浓度为0.8 mol/L左右，pH为8左右，吸附时间为8—10 h。吸附结束后，收集树脂，第1次洗脱依次用55℃pH 9的碱液洗涤20 min，55℃盐浓度为0. 82 mol/L的盐水洗涤20 min，55℃盐浓度为4.5 mol/L的盐水洗脱4h，洗脱结束后收集洗脱液，静置冷却，再将树脂放在55℃盐浓度为4.5 mol/L的盐水进行第2次洗脱，洗脱2h。洗脱结束后收集一二次洗脱液混合进行醇沉，加入90%酒精进行沉淀，沉淀24 h后，将上清液倒去，将沉淀加入水溶解，然后进行氧化步骤。氧化步骤首先将pH调至11.5左右，加入双氧水氧化，初加入时pH会降低，需进行补碱操作，氧化时间为6h左右，氧化完成后用亚硫酸氢钠中和多余的双氧水，然后将pH调至1.8左右，加入盐酸进行酸沉，酸沉之后离心取上清液。将pH调至5左右，电导率调至50 mS左右，然后进行醇沉，电导率在10 mS左右，醇沉之后进行脱水干燥，最终得到类肝素产品。
1.2.2 类肝素效价的测定方法
采用冷冻羊血浆法测定类肝素效价。称取类肝素原料或量取类肝素注射液适量，按估计效价用0.15 mol/L的NaCl溶液稀释至标准溶液(8 U/mL)相当的效价浓度，根据绵羊血浆的半凝固点分别吸取样品和标准品的3到5个梯度，加1 mL绵羊血浆和0. 02 mol/L的CaCl2溶液0.8 mL，置于(37±0.5)℃水浴t h，记录每管凝结程度，类肝素效价计算式为：
x=(VS×V×Cs)／（V×Wm) (1)
得到类肝素的总单位为：
Ut5=Xxm (2)
式中，X为类肝素效价，U/mg；Vs为标准品1/2凝固度的肝素加入体积，uL；Cs为标准品溶液的浓度，U/mL；Vm为样品1/2凝固度时的样液加人体积，uL；W为样品称取的质量，mg；V为测定样品的总体积，mL；m为类肝素的质量，mg。
1.3单因素实验设计
在吸附工艺中，单因素包括吸附温度、pH、盐浓度。将现有车间工艺作为平衡工艺，使其中1个工艺参数进行改变，其他参数保持不变，从而得到一个合理的参数范围。
1.4 类肝素提取工艺的优化
依照单因素试验结果，利用正交软件design -Expert设计各个步骤的单因素进行正交实验。
2结果与分析
2.1 废蛋白酶解实验
在肝素生产工艺中有酶解工艺，为了验证提取类肝素工艺中是否还需进行酶解实验，将相同批次的等量蛋白进行对比实验，第1组进行酶解反应，加入2709酶的酶量为1g/L，温度为53℃，pH为8.5左右，盐浓度为0.6 mol/L左右，保温时间为3h。保温结束后升温至80℃，灭酶活反应15 min，编号为1。第2组不进行酶解反应，将该组吸附条件调至与第1组一致，其他步骤反应条件也保持一致，编号为2。得到的对比实验结果如表1所示。
由表1可以看出，酶解与否对于最后得率、吸光度、旋光度都没有显著的影响，考虑到工业生产成本，对废蛋白的酶解步骤可以省略掉。
2.2废蛋白吸附实验
2.2.1 吸附温度对类肝素得率的影响
吸附条件设定在pH为8，盐浓度为0.8 mol/L，吸附时间为8h，考察吸附温度对类肝素得率的影响，结果如图2所示。由图2可见，当温度为59℃时，类肝素的得率最高。温度过低会影响树脂的吸附能力，温度过高会破坏类肝素的稳定性，影响得率。
2.2.2 吸附pH对类肝素得率的影响
吸附条件设定在温度为59℃，盐浓度为0.8 mol/L，吸附时间为8h，考察吸附pH对类肝素得率的影响，结果如图3所示。由图3可以看出，pH为8.5时，类肝素得率最高。
2.2.3 吸附盐浓度对类肝素得率的影响
吸附条件设定在温度为59℃，pH为8.5，吸附时间为8h，考察吸附盐浓度对类肝素得率的影响，结果如图4所示。由图4可以看出，盐浓度为0.7 mol/L时，类肝素得率最高。
2.2.4正交实验优化吸附工艺结果
依据单因素试验结果，利用design -Expert软件对废蛋白吸附工艺的温度、盐浓度、pH进行因素Box -Benhnken设计。产生17个试验，试验因素水平如表2所示，结果如表3所示。
从表3中可看出，选用的废蛋白中提取类肝素总单位数回归模型具有高度的显著性(P<0.0001)。失拟项在a=0.05水平上不显著(P=0.0501>0. 05)，其校正决定系数为0.9930，表明此模型可解释99. 300/0响应值的变化，仅有0.70%的总变异不能由此模型进行解释。复相关系数为0. 983 9，说明该模型拟合程度良好，试验误差小。同时从F值和P值可以看出，温度对提取效果的影响显著(P<0. 01)。
2.2.5正交实验优化工艺参数的试验验证
利用构建的类肝素总单位数回归模型进行模拟得到不同的最优工艺路线，不同工艺路线模拟值与真实值比较结果如表4所示。
从表4可以看出，在优化条件下，类肝素总单位数的预测值与实际值具有很好的相关性，可利用上述模型对实际吸附过程进行预测和控制。类肝素吸附工艺经过优化实验后，最佳工艺参数最后确定为：温度为55cC，盐浓度为0.8 mol/L，pH为8.72。
2.3粗品类肝素的氧化提纯
废蛋白经过吸附后，再经过脱附、醇沉步骤后，可以得到类肝素粗品，但由于杂质很多，效价很低，旋光度、吸光度都达不到质量要求，因而需要进行氧化提纯。
2.3.1 双氧水的量对类肝素得率的影响
将类肝素粗品按照质量比为1：15用水进行溶解，pH调至11.5，均分为6份，加入不同量的双氧水进行氧化，分别是体积比1：100、2：100、3：100、4：100、5：100、6：100，对应为6组。氧化时间为6h，氧化结束后将pH调至7，加入亚硫酸氢钠除去多余的双氧水，之后将pH调至1.8，进行酸沉，离心除去固体，取上清液，进行醇沉。醇沉终点控制在电导率为10 mS左右，醇沉时间为12 h，结束后将固体烘干，得到类肝素产品。结果如图5所示。
从图5可以看出，双氧水浓度过低、过高都会导致类肝素得率下降。这是因为过低时，杂质没有完全氧化，影响到效价；而过高时，双氧水会破坏类肝素分子。当双氧水体积比为2：100时，类肝素得率最高。
2.3.2氧化时间对类肝素得率的影响
实验条件同2.3.1中一样，当双氧水体积比为2：100时，氧化时间(2、4、6、10、15、24 h)对类肝素得率的影响如图6所示。
从图6可以看出，氧化时间为6h时，类肝素得率最高。类肝素得率不会随着氧化时间的增加而提升，这是因为类肝素存在的形式是与其他物质结合在一起，时间越久，解离率越高，有效成分被氧化的越多，得率越低。
因此，在提取类肝素的工艺中，最佳氧化条件为加入双氧水量的体积比为2：100，氧化时间为6h。
3结论
提出了从肝素提取过程中产生的副产物废蛋白里提取类肝素的工艺，通过单因素试验与正交试验优化确定了吸附工艺的最佳条件：温度为55℃，盐浓度为0.8 mol/L，pH为8.72。氧化工艺最佳条件为：加入双氧水的量的体积比为2：100，氧化时间为6h。该工艺使废蛋白变为类肝素，对现有的肝素企业也有很好的参考价值。
4摘要：
提出了一种从肝素提取过程中产生的废蛋白中提取类肝素的工艺。以类肝素总单位数为评价指标，通过单因素实验和正交设计实验确定了吸附工艺最佳条件：温度为55℃，盐浓度为0 8 mol/L，pH为8.72。氧化工艺最佳条件为：加入双氧水的量与待氧化的类肝素粗品溶液体积比为2：100，氧化时间为6h。与传统的处理废蛋白的方式相比，有效地增加了其经济价值。
