作者：郑晓敏
以牛乳为原料生产的乳基婴幼儿配方食品中蛋白组分的来源主要为牛乳的蛋白。牛乳中的蛋白质可大致分为酪蛋白和乳清蛋白两大类，其中酪蛋白占乳蛋白的约80%，酪蛋白由αs1-酪蛋白（αs1-CN）、α一酪蛋白（αs2-CN）、β一酪蛋白（β-CN）和K-酪蛋白( K-CN)四种蛋白质组成，且4种酪蛋白分别占总酪蛋白的40%，10%，40%和10%；乳清蛋白占乳蛋白的约20%，乳清蛋白主要由3-乳球蛋白（β-LG）、α一乳白蛋白（a-LA）、免疫球蛋白(Ig)和血清白蛋白( SA)组成，它们分别约占总乳清蛋白的500/0，20%，8%和5%。乳清蛋白和酪蛋白相比，乳清蛋白能为婴儿提供更高的营养，另外婴儿的消化系统也更易消化乳清蛋白而非酪蛋白。成熟母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例为60：40。为了使婴儿配方食品更接近母乳，为婴儿提供更利于其生长的营养，我国市售的乳基婴儿配方粉都通过添加乳清蛋白来调整乳粉内乳清蛋白的含量。
目前对于牛乳中蛋白含量的测定包括：凯氏定氮法、高相液相色谱法、双缩脲法、分光光度法、四阶导数分光光度法、凝胶电泳法、毛细管电泳法和氨基酸折算法等。而对于乳粉内乳清蛋白含量的检测，目前国内主要依据GB/T 5413.2-1997，该法检测时用光密度计来检测不同蛋白的光密度，最后通过计算不同蛋白的光密度来计算乳清蛋白的含量。此法存在一定的缺陷，因为不同的蛋白质结合考马斯亮蓝的能力不同，相同浓度的不同蛋白就会表现出不同的光密度值，最后会造成检测结果的准确度较低，误差较大。因此急需探寻一种更加准确、操作简单、成本低、且能适用于婴幼儿食品这一复杂体系中乳清蛋白含量的检测方法。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
标准品：α-酪蛋白、β-酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、α-乳白蛋白和β一乳球蛋白，美国Sigma公司；丙烯酰胺( Acr)、Tris、N-N甲叉双丙烯酰胺( Bis)、TEMED、十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸铵( Ap)、2×SDS-PAGE上样缓冲液，上海迪申生物；冰醋酸、甲醇、甘油、考马斯蓝R-250，溴酚蓝和甘氨酸等，国药集团。自配婴儿配方粉，光明乳业中试车间；婴儿配方粉，市售。
1.2仪器与设备
Mini-PROTEAN Tetra Cell电泳槽（美国Bio-Rad公司）；164-5050 Powerpac Basic电泳仪（美国Bio-Rad公司）；Gel DocrM XR+成像系统（美国Bio-Rad公司）；脱色摇床TS-1000（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；分析天平（梅特勒一托利多集团）。
1.3方法
1.3.1 电泳分析方法
利用不连续聚丙烯酰胺凝胶分离乳粉内的蛋白组分。
分析条件：凝胶放置于装有电泳液（电泳液pH为8.6．Tris 25 mmol/L，甘氨酸192 mmoIL，SDS1 g/L）的电泳槽内进行分析，先40 mA恒流电泳40 min，再把电流调为30 mA恒流电泳至蓝色条带距胶底部0.5 cm处止。然后移出电泳后的电泳胶，用0.1%的考马斯亮蓝染色液（冰醋酸75 mL，甲醇100 mL，考马斯亮蓝R-250 1 g，超存水825 mL配制成1 L染色液）染色约1.5 h。再用脱色液（冰醋酸75 mL，甲醇100 mL，超存水825 mL配制成1 L脱色液）脱色至背景透明。最后用成像仪拍照并用Quantity One图像处理软件计算。
1.3.2标准品及样品处理方法
酪蛋白标准蛋白混合样：α-酪蛋白、β-酪蛋白和k一酪蛋白以质量比4:3:1配制成终蛋白质量浓度为1.70 mg/mL的酪蛋白水溶液；乳清蛋白标准蛋白混合样：β一乳球蛋白、α-乳白蛋白和血清白蛋白以质量比8:3:1配制成终蛋白质量浓度为1.43 mg/mL乳清蛋白水溶液。待检样品处理方式为：将待检样品溶解于超纯水中，控制待检样溶液内蛋白质含量的终质量浓度在2—4 mg/mL范围内。两种混合标准蛋白水溶液和待检样溶液分别和2×SDS-PAGE上样缓冲液等体积混合均匀，水浴煮沸3～5 min．然后迅速移入到冰水中冷却，备于后续检测。
1.3.3数据处理方法
利用chemiDoc XRS+成像系统的Quantity One图像处理软件处理图像，得出不同蛋白条带总的trace值，然后以如下方法计算乳粉内乳清蛋白占总蛋白的量。
计算方法为：检测样内6种蛋白质( α-CN、β-CN、K-CN、SA、α-LA和β-LG)的trace值分别除以对应的两种混标内6种蛋白质的trace值，再分别乘以每种标准蛋白的上样量，计算出检测样内6种蛋白的质量。最后通过检测样内3种乳清蛋白( SA、α-LA和β-LG)与6种蛋白质（α-CN、β-CN、K-CN、SA、α-LA和β-LG）的比值计算得出乳清蛋白占总蛋白的百分比。
2结果与分析
2.1分离胶浓度的确定
不同浓度的分离胶进行电泳试验的图谱及图谱条带的trace值扫描图见图1和图2。由图l可知，10%和12%的分离胶浓度下电泳的条带都有8条，15%的分离胶浓度下仅有7条。再对比10010的分离胶和12%的分离胶图谱中条带4和5可以发现，在分离胶12%的情况下乳粉样的蛋白可以得到最大限度的分离。这一结论可以通过图2的条带trace值扫描图得到进一步的证实，10%的分离胶浓度下条带4和5没有在12%的浓度下分离效果好。因此，用于后续试验的分离胶浓度确定为12%。
2.2 电泳样品上样量及检测方法的确定
如图3所示为蛋白质上样量选择的电泳图谱及对应的扫描图，由图3所示，蛋白质上样量为1.49和2.89μg时，图谱的条带清晰度不高，且在其扫描图(图3B)上响应值明显的条带仅有6条。这说明上样量低，乳粉内含量低的蛋白质很难在SDS-PAGE凝胶上显现。当蛋白质的上样量达到10.12μg以上时，条带5的分离效果不好，因此建议将乳粉内蛋白质的的上样量控制在4.34—8.67 μg范围内。
图4是标准蛋白与待检样蛋白的SDS-PAGE图谱及对应条带trace值的扫描图，是进行样品检测时上样方式和计算方式的示意图。结合图3及图4可知婴幼儿粉内主要的蛋白质有6种（α-CN、β-CN、K-CN、SA、α-LA和β-LG）。试验计算乳粉内乳清蛋白占蛋白质含量的计算方法是，首先得出样品和标准品内a-CN、3-CN、K-CN、SA、a-LA和3-LG这6种蛋白质条带总的trace值（利用Quantity One图像处理软件高斯建模后的trace值），再通过标准蛋白的上样量计算所得（具体方法见1.3.3）。
2.3标准蛋白上样量的确定
表1所示为两种标准蛋白混合样不同上样浓度检测同一样品乳清蛋白含量的结果。该结果显示酪蛋白标样的上样量从2.13—7.46 μg，乳清蛋白标样的上样量从1.79—6.26 μg，检测同一样品，可以得到一致的结果。这一结果说明在一定范围内标准蛋白的上样量大小不会造成检测结果的差异，同时也说明该检测方法的可操作性高。但是，考虑到试验的经济型和结果的稳定性，建议标准蛋白的上样量为，酪蛋白混标5μg左右，乳清蛋白混标4 μg左右。
2.4不同乳清蛋白含量乳粉内乳清蛋白含量的测定
根据婴儿配方粉生产工艺，实验室自行配制了乳清蛋白含量不同（乳清蛋白含量50%．55%，60010，65%．700/0和75%）的乳粉。然后用上述检测条件对这些乳粉进行检测，检测结果如表2所示。该检测结果所示，检测值与理论值一致。且检测值的相对标准
偏差( RSD)在1.85%—4.35%之间，说明方法的重复性良好。
2.5市售乳粉内乳清蛋白含量的测定
研究随机采集市售的乳基婴儿配方粉12种，分别用SDS-PAGE电泳分析其乳清蛋白的含量。分析结果见表3，由该结果可见，所检测的市售乳基婴儿配方粉都能满足我国食品安全国家标准GB/T 10765-2010“婴儿配方食品”的规定，乳清蛋白的含量占总蛋白含量的60%以上。但是检测结果也显示，不同品牌的乳粉，其乳清蛋白占总蛋白的比例存在较大的差异，含量最低的仅为60.4%，刚刚满足国家标准GB/T10765-2010的要求，含量较高的能达到70%左右。
3结果与讨论
利用SDS-PAGE凝胶电泳分析乳粉内乳清蛋白（α-乳白蛋白、乳铁蛋白和β一乳球蛋白）的含量进行半定量分析，可以得到理想的结果。试验建立的SDS-PAGE法测定乳基婴儿配方食品内乳清蛋白含量的操作条件为：浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度12%．40 mA恒流电泳40 min，再30 mA恒流电泳至电泳结束。依据婴幼儿乳粉内主要蛋白组分( α-CN、β-CN、K-CN、SA、α-LA和β-LG)来推算乳粉内乳清蛋白占总蛋白的比例，上样量为标准酪蛋白混标5μg左右，标准乳清蛋白混标4μg左右，计算方法和标品的上样情况都得到了简化。建立的SDS-PAGE电泳分析方法，能够做到对婴幼儿乳粉内的乳清蛋白进行半定量分析，方法操作简便，重复性好，可以应用于乳粉内乳清蛋白含量的计算。
4 摘要
采用SDS-PAGE对乳基婴幼儿配方食品内乳清蛋白进行了分离和定量分析，优化了试验条件，简化了数据的处理方法。结果表明采用该法对乳粉内6种重要蛋白(α-酪蛋白、β-酪蛋白、K-酪蛋白、β一乳球蛋白、α-乳白蛋白和血清白蛋白)能实现较好地分离，依据乳清蛋白和酪蛋白的比值可以推算出乳清蛋白在乳粉内的含量。对乳清蛋白含量不同的乳粉及市售婴儿粉的测定表明，SDS-PAGE法是一种操作简便、准确快速测定乳粉内乳清蛋白含量的方法。
