作者：田嘉
有机酸是果汁中主要的风味营养物质，其含量高低与果汁制品的品质有着密切关系。此外，果汁中的有机酸还可促进消化腺的活动，改善患者的食欲，有助于食物的吸收。天然果汁营养丰富，深受消费者青睐。然而，由于水果原料和生产成本的限制，果汁的掺假现象时有发生，一些商家为了追求利润，通常向少量原果汁中加入一些柠檬酸等酸味调节剂而勾兑成果汁，或者将香精、色素、防腐剂、甜味剂和柠檬酸等添加剂勾兑在一起，以次充好，以假乱真，造成了市场的混乱。因此果汁掺伪检测成为国内外关注的焦点。
我国梨的优质果率较低，削弱了梨果的市场竞争力，且大多数品种梨的贮藏性能有限，因此除一部分鲜食外，及时的将梨进行加工制汁，既能满足广大消费者的需求又可以解决鲜梨的销售问题。梨汁中主要存在的有机酸有：苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、莽草酸、奎宁酸、富马酸、乳酸等，其中苹果酸和柠檬酸为主要有机酸，而果汁掺伪中的重要成分
亦为柠檬酸和苹果酸。另外，由于梨果中的苹果酸主要为L-苹果酸，通常不含D-苹果酸，即使有含量也非常小，因此，通过测定梨汁中柠檬酸和L-苹果酸的含量及相互比例，可以鉴别梨汁的掺假现象。如果柠檬酸含量超过一定比例或有D-苹果酸存在，即可判定该梨汁中添加有外源性柠檬酸或DL型苹果酸。
有机酸含量的测定方法主要有：化学滴定法、荧光法、比色法、气相色谱法、薄层色谱法等方法。化学滴定法一般只用于测定食品中的总酸度；后面几种方法虽然可以检测单个的有机酸的含量，但是样品前处理较繁琐。高效液相色谱法( HPLC)具有简便、迅速、灵敏度高、重复性好、结果准确的特点，是目前主要方法。试验通过选取不同地区不同品种的梨果加工成梨汁后，以反相高效液相色谱法测定该梨汁中柠檬酸和苹果酸的含量，以柠檬酸和L-苹果酸含量之比作为判断梨汁中是否添加柠檬酸的依据；以是否有D-苹果酸作为判断梨汁中是否添加DL型苹果酸的依据。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
不同品种的梨果在0℃下贮藏20 d，未受到其他污染物的污染，品质良好。梨汁样品：市售。
柠檬酸、L-苹果酸和D-苹果酸标准品：河北省食品质量监督检验研究院提供，纯度大于99.0%；甲醇（色谱纯）、磷酸二氢钾、磷酸（分析纯）：天津康科德科技有限公司；试验用水均为超纯水；0.45 μm有机相微孔滤膜：天津市沃尔孚科技发展有限公司。
1.2仪器与设备
LC-20A高效液相色谱仪（配有SPD-20A型紫外检测器和LC solution工作站）：日本岛津公司；AL204万分之一电子天平：梅特勒一托利多有限公司；TG18G高速离心机；盐城市凯特仪器有限公司；KUDOS-SK5200LHC超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司；PTD-20-3超纯水制备仪：上海力新仪器有限公司；PB-10型pH计：德国赛多利斯。
1.3试验方法
1.3.1标准曲线的绘制
用电子天平分别精确称取400 mg的柠檬酸、L-苹果酸和D-苹果酸标准品用超纯水溶解并定容至100 mL的容量瓶中。将上述溶液配置成不同浓度的混标，经0.45 μm微孔滤膜过滤后，各取20 μL上色谱仪进样分析。以标准样品的质量浓度为横坐标、相应的峰面积为纵坐标，获得柠檬酸、L-苹果酸和D-苹果酸的标准曲线及相关系数。
1.3.2样品前处理
适时采收不同品种的梨果，在0 oC下贮藏20—30 d后，按以下工艺流程制成梨原汁，冷冻保存待分析测定。
原料→破碎→榨汁→离心→澄清斗过滤→原汁→冷冻贮藏
将待测样品用超纯水稀释5倍，经0.45 ym微孔滤膜过滤后测定，供HPLC分析，每个样品重复测定3次，取其平均值。
1.3.3液相色谱条件
色谱主为GREEN ODS-AQC18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流动相为甲醇和0.01 mol/L磷酸二氢钾（体积比为3：97，pH 2.9用磷酸调配），检测波长为210nm．流速0.5 Ml/min;柱温30℃，进样量20μL。
1.3.4梨汁样品中柠檬酸和苹果酸含量的测定
对梨汁样品平行测定5次，根据标准品的色谱图，对试样中的柠檬酸和苹果酸的含量进行定性和定量分析。
2结果与分析
2.1检测方法的确定
2.1.1色谱分离条件的确定
在有机酸的测定方面，常用检测波长为210 nm常用色谱柱为C18柱，流动相为磷酸盐缓冲体系。由于纯磷酸盐流动相会增加对色谱柱的损坏程度，为了使有机酸得到更好的分离效果，试验比较了Agilent Eclipse XDB-C18( 4.6 mm×150 mm,5μm),Welch Vltimate XB-C18( 4.6 mm×250 mm,5μm)和BOSTON GREEN ODS-AQ Cla（4.6 mm×250 mm，5斗m）不同的C18柱、不同配比的甲醇一磷酸盐溶液、流动相pH、流速以及柱温等因素对有机酸分离的影响，最终得到的色谱分离条件如下：色谱柱，BOSTON GREEN ODS-AQ C18柱(4.6 mmx 250 mm,5μm)；流速，0.5 mL/min；流动相，甲醇和磷酸二氢钾(体积比为3：97，pH 2.9)；柱温，30℃。图1为该条件下测定的柠檬酸和苹果酸的标准色谱图，图2为纯梨汁色谱图。
2.1.2混合标准品的标准曲线和检出限
将配制好的质量浓度分别为0.02, 0.05，0.10．0.50，1.00，2.00和4.00 mg/mL的混合标准溶液液，按2.3.3的色谱条件进行HPLC分析，平行测定3次。以峰面积(Y)对质量浓度X(mg/L)进行线性回归，绘制标准曲线，得到回归方程及相关系数。根据十倍噪音的峰面积响应值和方法回收率，得到柠檬酸和苹果酸的最低检出限。测定表明，柠檬酸的检出限为0.3μg/mL，L-苹果酸的检出限为0.2 μg/mL，D-苹果酸的检出限为0.5μg/mL。柠檬酸和苹果酸的回归方程，相关系数和最低检出限如表1所示。
2.1.3方法回收率及精密度的测定
试验分别取1.0 mL的同一梨汁四份稀释5倍后，其中一份作空白样品（梨汁样品的色谱图如图2所示），另三份分别添加一定量的柠檬酸，L-苹果酸和D-苹果酸，柠檬酸的添加水平分别是0.2和0.8 mg/mL，L-苹果酸的添加水平分别是0.5和1.5 mg/mL，D-苹果酸的添加水平分别是0.01和0.02 mg/mL。按照前述检测条件分别测定各成分含量，每份样品进行6次平行检测，考察方法的回收率和精密度。测得的回收率及相对标准偏差如表2所示。结果表明，梨汁样品在3个添加水平下，样品中柠檬酸和L-苹果酸的回收率在91.7%—101.9%之间，相对标准偏差在0.12%—1.55%之间，说明该方法准确度和精密度良好，能够满足样品测试的要求。
2.2不同品种梨汁中柠檬酸和苹果酸的含量和比例
按上述色谱条件，对不同产地及品种梨汁中的柠檬酸和L-苹果酸进行测定，每种检测4次求得其平均值，结果如表3所示。由于D-苹果酸在测定过程中的含量几乎为零，因此表3中不再列出。
由表3可知，河北产地的鸭梨和雪花梨中柠檬酸的含量分别为1.13和0.29 mg/mL，苹果酸的含量分别为1.96和1.86 mg/mL．柠檬酸和苹果酸的比例分别为57.7%和15.6%；天津产地的鸭梨和雪花梨中柠檬酸的含量分别为1.11和0.26 mg/mL，苹果酸的含量分别为1.74和1.81 mg/mL，柠檬酸和苹果酸的比例分别为63.8%和14.4%。对于同一品种的纯梨汁，产地对柠檬酸和L-苹果酸的比例影响相对较小。但是在不同品种间差别较大，其比例范围在5.82%—64.2%之间，其中以新疆产的大果水晶梨中柠檬酸和L-苹果酸的比例最高，但其比均小于100%，即所有纯梨汁中柠檬酸的含量均小于L-苹果酸的含量.由此可以推断，当某一品种梨汁中柠檬酸和和L-苹果酸的比例出现剧烈变化，其比值超过l时，即可判断此果汁中添加了外源有机酸——柠檬酸；检测中若有D-苹果酸的色谱峰，则可推断果汁中添加了外源有机酸-DL-苹果酸。
2.3市场梨汁中柠檬酸和苹果酸含量测定
由图1可知，苹果酸的保留时间在8.4 min左右，柠檬酸的保留时间在14.6 min左右。图3同图l相对照可知，梨汁样品中含有柠檬酸和L-苹果酸。根据表1的相关方程，通过外标法计算得出梨样品1中柠檬酸和L-苹果酸的含量分别为2.968和0.045 mg/L，两者的比例为6 595.6%;梨样品2中柠檬酸和L-苹果酸的含量分别为1.303和0.214 mg/L，两者的比例为608.9%，与表3相比比例大大超出了正常果汁的比例范围，这表明这两种梨汁样品中均添加了外源有机酸——柠檬酸。
3结论
1)利用HPLC法在BOSTON GREEN ODS-AQ C18柱色谱柱上，以体积分数3%的甲醇和0.01 mol/L的磷酸二氢钾( pH 2.9)为流动相，可将果汁中的柠檬酸，L-苹果酸和D-苹果酸进行较好地分离。该方法操作简单，相对标准偏差为0.120/0—1.55%，回收率为91.7%—101.9%．两种酸的线性相关系数R2均大于0.999。
2)梨汁中以柠檬酸和L-苹果酸为主，这两种有机酸的含量在不同品种间差别较大，而在同一品种不同产地梨汁中差别较小，但其含量之比均小于100%，根据此比例关系可确定果汁中是否添加有外源有机酸——柠檬酸。
由于当前果汁掺伪问题主要是单独添加柠檬酸，因此，当梨汁中添加少量的柠檬酸后即会急剧改变梨汁中柠檬酸和苹果酸的比例，通过监测变化即可判定梨汁中是否添加外源有机酸。同时可根据检测得到的D-苹果酸的含量，判断果汁中是否添加了DL-苹果酸。该方法快速，简便，准确，可靠，为生产企业及监管部门开展梨汁的掺伪鉴别提供了依据，但不适用
于按比例同时添加柠檬酸和L-苹果酸等多种外源有机酸掺伪梨汁的检测。
4摘要
柠檬酸和L-苹果酸是梨汁中2种主要有机酸。研究了利用高效液相色谱法分离测定梨汁中柠檬酸、L-苹果酸和D-苹果酸的条件，同时对来源于不同产地和品种梨汁中的柠檬酸和L-苹果酸的含量进行了测定。研究结果表明，不同品种梨汁中柠檬酸与L-苹果酸的含量和比例差别较大，同品种梨汁中这两种有机酸的比例差别不大。但是，在所有梨汁中柠檬酸的含量均小于苹果酸的含量，即，柠檬酸和L-苹果酸含量之比小于100%。因此，当梨汁中这两种有机酸的比例出现剧烈变化时，即可判定添加了外源有机酸。该方法解决了外源有机酸难以鉴别检测的难题，为生产企业及监管部门开展梨汁的掺伪鉴别提供了依据。
