如何测定盐藻中脱镁叶绿素含量?

    作者：张磊             

    叶绿素极不稳定，在光照、氧、酸和温度的条件下，极易被破坏。叶绿素在稀碱液中可皂化水解成鲜绿色的叶绿酸（盐）、叶绿醇和甲醇。在酸溶液中可成暗绿至绿褐色的脱镁叶绿素[10]。杜氏盐藻主要含有叶绿素a，由于其对光、热和酸敏感，性质极不稳定。在遇酸的时候，中心金属镁被氢置换脱离成暗绿色至暗褐色的脱镁叶绿素，加热可以促使脱镁反应的进行；而叶绿素在稀碱中水解后生成的叶绿酸仍呈绿色并易溶于水，比较稳定，但是脱镁以后变为脱镁叶绿素，色泽呈暗褐色[11-13]。研究发现，脱镁叶绿素对小鼠具有光过敏毒性，是引起日光性皮炎的光敏性物质[14]。由于盐藻中含有B一胡萝卜素和叶绿素等色素，当前科学界普遍使用的测定方法是先用85%丙酮将藻粉中的基本色素萃取出来，在通过无水硫酸钠除去丙酮和水，然后将色素转移到无水乙醚中，再用盐酸将脱镁叶绿素提取出来，通过分光光度法来确定其含量[15-16]。这一方法，在具体的分析测定过程中，存在很多不稳定的因素[17]，比如光照以及细胞破碎的程度或者盐酸的用量等。因此，考察了在盐藻中测定脱镁叶绿素的过程中，细胞的破碎方法、丙酮及盐度积分数等对脱  镁叶绿素测定的影响，研究了影响脱镁叶绿素含量测 定的主要因素以及最优条件。

    1  材料和方法

    1.1藻种的培养

    藻种由内蒙古吉兰泰生物工程公司提供，培养方 法见文献[5]。培养到可采收浓度待用，采收计数及方 法详见研究报导[18-19]。

    1.2药品

    盐酸：北京市朝阳区化工四厂；丙酮：天津市永大化学试剂开发中心；无水硫酸钠：天津市化学试剂三厂；无水乙醚：天津市永大化学试剂开发中心。所用药品均是分析纯。

    1.3试验方法

    1.3.1细胞的破碎

    细胞破碎的方法很多，可以分为物理法（机械法）和化学法两类。常用的物理方法有研磨法、捣碎法、高压法、超声波法和反复冻融法等；化学法有渗透、干燥、自溶、酶处理、表面活性处理等方法[20]。无论是机械破碎法还是非机械法破碎细胞都有自身的局限性和不足，应根据破碎细胞的目的、回收目标产物的类型和它在细胞中所处的位置，选用合适的方法，达到选择性的分步释放目标产物的要求[20]。不同类型的细胞需要使用不同的细胞破碎方法，杜氏盐藻无细胞壁，其形状随着渗透压变化在发生变化。由于上述特点，在提取叶绿素和脱镁叶绿素的时候，选择了超声波破碎法和反复冻融法。反复冻融法是将细胞在低温下冷冻，然后在室温下融化，反复多次使细胞破碎。超声波破碎法是根据大量的声能转化为弹性波形式的机械能，引起细胞液局部的剪切梯度致使细胞破碎。

    1.3.2脱镁叶绿素的测定

    将盐藻细胞破碎以后，用配制好的85%丙酮溶液提取色素，重复三次，定容，将其转入无水乙醚中，并重复加入5%的无水硫酸钠反复洗去丙酮和水；然后加入固体硫酸钠除去无水乙醚中少量的水，再将其转入17%的盐酸当中，最后再经过饱和硫酸钠脱去盐酸进入到无水乙醚层中，定容后。使用分光光度计测定在一定波长下的吸光度。试验中尝试了不同配比的丙酮、精馏乙醚、不同浓度的无水硫酸钠和不同体积分数的盐酸对测试结果的影响。

    2结果和分析

    2.1  冻融法破碎藻细胞

    多次试验证明，反复冻融法破碎藻细胞是不可行的。试验把培养好的盐藻经过冰箱里反复冻融四次，发现藻细胞形态良好，没有丝毫异常。藻细胞如图1所示。藻细胞可以在0C—38 0C的温度内生存[7]，甚至有人观察到在零下的环境中也能生存，故反复冻融法对于盐藻细胞的破碎是难以实现的。

    2.2超声波破碎法

    超声波破碎法对与藻细胞是十分有效的。在超声波功率达到300 W时候，只要1 min藻细胞已经完全破裂。破碎后的盐藻细胞如图2所示。试验证明，超声波破碎盐藻细胞是完全可行的。

    2.3丙酮浓度

    试验对脱镁叶绿素的测定方法作了如下几步的探索。先从丙酮人手，试验尝试了50%，60%，70%,80%和90%的配比，但是其结果没有太大的变化，也很难看出丙酮的浓度与脱镁叶绿素含量的相关性。丙酮浓度对脱镁叶绿素测定结果的影响见表1。

    2.4精馏乙醚

    无水乙醚经过精馏之后，用于提取色素。以未蒸馏的无水乙醚为对照。试验结果见表2。试验表明使用精馏乙醚对脱镁叶绿素含量没有明显的改变。

    2.5无水硫酸钠的浓度和洗涤次数

    试验使用了多组不同浓度的和不同次数的无水硫酸钠洗涤，脱镁叶绿素含量与未改变条件之前相比均没有太大的变化。

    2.6盐酸体积分数

    常规的检测方法中，盐酸的加入量为17%。在多次试验过程中，发现盐酸的配比牵涉到了从无水乙醚中萃取色素量的大小，盐酸层的颜色可以间接的反应出了脱镁叶绿素含量的高低。因此尝试加大盐酸量。试验选取了不同盐酸的配比，对其标样进行了平行试验，测定的脱镁叶绿素含量见表3。由表3中可以看出，当盐酸配比达到了26%的时候，所得到的脱镁叶绿素的含量与标样的有关数值一致。

    由试验数据可以得出，盐酸体积分数在26%左右时，所测得的脱镁叶绿素含量数值与标样测定的结果相接近。试验继续在25.00%—25.80%之间测定样品的脱镁叶绿素的含量，每组盐酸体积分数相同的样品，平行取三个样，得出平均值如表4。并且又重新测定了其他标准样品，数值与实际结果基本接近。由此可以得出，当盐酸体积分数为25.80%时，测定值最接近标样的实际值。

    3结论

    试验通过对脱镁叶绿素测定方法的探索，得出了盐酸体积分数是影响其测定效果的主要因素。试验初步确定了盐酸体积分数是25.80%时，测定的脱镁叶绿素的含量较接近标样的实际数值。改进后的脱镁叶绿素的检测方法可用于食品行业中脱镁叶绿素含量测定的参考。

    4摘要

    考察了盐藻中测定脱镁叶绿素含量的过程中，细胞的破碎方法、丙酮及盐酸体积分数等对脱镁叶绿素含量的影响，得出了盐酸体积分数对脱镁叶绿素含量的测定影响最大的结论并且确定了盐酸配比是25.80%时，测定的脱镁叶绿素的含量较接近标样的实际数值。