作者：郑晓蒙
本文选取了不同营养水平沉积物样品，进行了理化指标和氨氧化元和生物的丰度和群落结构分析以阐述两者之间的关系。
1材料与方法
1.1样品采集
研究选取位于安徽省东部城市滁州市域内的花山水文实验流域，实验流域范围在东经11908′8〞—1180 16'50”、北纬32013′16〞～32018'52〞之间。距滁州市主城区10 km处，面积82.1 km2。
花山水文实验流域四面环山，流域内河系呈标准的扇形，分别为东源、中源、西源和竹园沟。
2013年12月27日，在流域东源、中源和西源的水库或者小型湖泊各选取一个采样点，分别为龙库( 32.26311N．118.253067E)、狮子山坝(32.25508N,118.202897E)和红旗水库(32.27044N，118.171449E)。见图l。使用柱状采泥器（德国HYDRO-BIOS）采集柱状沉积物，每个采样点同时采集3个平行样品进行混合。所有样品采集后立即转移到无菌试管中，置于冰上冷藏，运回实验室等待进一步分析处理。在实验室内，切取每个柱状沉积物样品中表层
0—1 cm的部分，每个采样点的3个平行样品分层后进行混合。
1.2沉积物理化指标分析
采集的沉积物样品用冷冻干燥机( ALPHAI-2,CHRIST，德国)干燥后，根据IS0 13878-1998标准使用元素分析仪（EA3000，Euro Vector，意大利）测定总氮(TN)浓度。样品的氨氮(NH4+-N)、硝氮(N03- -N)、亚硝态氮（NO2--N）浓度用2 mol/L KC1从沉积物样品中提取，并用连续流动分析仪(San++，SKALER．荷兰)测定。
1.3 DNA提取
使用PowerSoilDNA提取试剂盒(MoBio Laboratory，Solana Beach，CA)从0.25 g沉积物样品中提取DNA，提取的DNA在0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。然后使用生物光度计（Eppendorf，Hamburg，德国）测出提取DNA的浓度。
1.4 实时定量定量PCR
使用IQ5 Thermocycler(RG65HD，Corbett，澳大利亚)PCR仪，应用SYBR Green I染料对之前提取的DNA进行了实时定量PCR扩增。古菌的amoA基因PCR扩增的引物为Arch-amoAF/Arch-amoAR，细菌的amoA基因PCR扩增的引物为amoA-lF/amoA-2R。
古菌和细菌的amoA基因PCR扩增的反应体系均为20 μL，包括5 ng DNA模板，lxSYBR PremixEx TaqTM缓冲液（Takara，日本），0.2 μmol/L古菌或细菌的amoA引物，超纯水补足至20 μL。古菌的amoA 基因PCR扩增的热循环程序如下：95℃3 min;95℃30 s,53℃1 min．72℃20 s，45个循环，最后72℃7 min。细菌的amoA基因PCR扩增的热循环程序如下：95℃3 min;95℃30 s,50℃1min,72℃20 s,45个循环；最后72℃7 min。
1.5克隆文库和系统发育分析
所有的amoA基因PCR反应用Ex Taq DNA聚合酶（Takara，Otsu，日本）进行扩增。对于每个样品取3份的PCR扩增产物合并，并用AxygenPCR纯化试剂盒纯化，然后与pGEM-T载体(Promega，Madison，WI，美国)连接。所得到的连接产物用来转化大肠杆菌感受态细胞（DH5c.．Takara．日本）。转化产物在含有100 yg/mL氨苄青霉素钠、40 μg/mL X-Gal和24
μg/mL IPTG的LB固体培养基上培养过夜。用载体引物（T7和SP6）验证阳性克隆并送上海美吉生物科技有限公司进行DNA测序。
所有amoA序列用BLAST与GenBank数据库序列进行比对。核酸序列差异≤5%的序列划分为一个操作分类单元( OTUs)。用软件程序DOTUR进行多样性指数和非参数丰度估计，公式C-[l-(n1/Ⅳ)]×100%（n1是单例序列数目，Ⅳ是序列总数目）用来计算amoA基因序列的覆盖率。用ClustalX进行序列比对，使用MEGA 4.0软件包以Jukes-Cantor距离为基础建立邻接的系统发育树。
1.6核苷酸序列登录号
此研究中获取的amoA基因序列已上传到GenBank数据库，古菌的amoA基因序列登录号是KJ583308-KJ583337(红旗水库)，KJ583458-KJ583487（狮子山坝）和KJ583518-KJ583547（龙库）；细菌的amoA基因序列登录号是KJ583644-KJ583690（红旗水库），KJ583876-KJ583923（狮子山坝）和KJ583974-KJ584021（龙库）。
2结果与讨论
2.1 沉积物理化指标
不同沉积物样品的理化指标测定结果如表1所示。3个采样点沉积物的pH值没有显著差异，均接近中性。不同样品的TN浓度差异很大，位于西源的采样点红旗水库的沉积物中TN浓度最高（991 mg/kg），其次是位于东源的采样点龙库（807 mg/kg），位于中源的采样点狮子山坝沉积物的TN浓度最低(755 mg/kg)。而采样点龙库的NH4+一N浓度最高，采样点红旗水库次之，浓度分别高达采样点狮子山坝的4倍和3倍。NO3--N浓度呈现相同规律，均为采样点龙库最高，采样点狮子山坝最低。
2.2 古菌和细菌amoA基因丰度
采样点红旗水库沉积物中古菌amoA基因丰度最高（1.72xl06拷贝／g干沉积物）．而采样点狮子山坝的最低（1.5)xlo5拷贝/g于沉积物）．采样点龙库的古菌amoA基因丰度大约是其2倍（图2）。不同沉积物样品细菌“聊拟基因丰度与占菌有明显不同，由大到小依次为采样点龙库( 2.11×108拷贝／g干沉积物）>采样点狮子山坝( 6.40xl07拷贝g干沉积物)>采样点红旗水库（2.02x107拷贝/g于沉积物）。所有沉积物样品的细菌amoA基因丰度均高于古菌amoA基因丰度，二者之间基本相差3个数量级。
2.3 AOA和AOB的多样性分析
古菌和细菌amoA基因序列总共分别有90和143条。每个采样点的古菌amoA基因序列均为30条，而细菌amoA基因序列相差不大（分别为47.48和48条）。古菌arnoA基因克隆文库可以划分为29个OTUs，而细菌amoA基因克隆文库可以划分为26个OTUs。对于每个样品包含的OTUs数目，古菌amoA基因变化不大（分别为8个、9个、I2个），而细．菌amoA基因每个样品包含的OTUs数日有6到13个（表2）。采样点红旗水库中细菌amoA基因OTUs的数目约为其他2个采样点的2倍，龙库只比狮子山坝中数目多1个。AOA克隆文库的覆盖率从80%到96.7%，AOB克隆文库的覆盖率变化不大，每个采样点均略大于90%。Shannon-Weiner(H’)多样性指数和amoA指数结果表明：采样点狮子山坝沉积物样品古菌amoA基因多样性最高，红旗水库沉积物样品中古菌amoA基因多样性最低：而采样点红旗水库样品细菌amoA基因多样性最高，另外2个采样点沉积物样品细菌amoA基因多样性差别不大。
2.4 环境因子与基因丰度以及OTU数的相关性分析
Pcarson木¨关系数分析结果表明：细菌amoA基因{OTUs数目显著正相相关于pH以及TN( P<O.Ol)，而古菌OTUs数目和和NO3--N呈现一定正相关关系（表3）
占菌和细菌的amoA基因丰度的差异可能是由于众多环境冈因引起的、这其中包括沉积物样品的营养水平氨氮作为氨氧化反应的底物，浓度不同会对氨氧化菌群落造成影响，Pearson相关系数分析结果表明，AOA的amoA基因丰度和pH以及TN浓度呈现明显的正相关关系，而AOB的amoA基冈丰度和这两者没有明显相关关系（表3）。TN浓度最高的采样点红旗水库中沉积物古菌amoA基因丰度最高，而最低的采样点狮子山坝沉积物古菌amoA基因丰度也最低- Christman等对夏季和冬季北冰洋水样进行研究发现古菌的amoA基因丰度与氨氮浓度呈正相关关系．另有研究表明，东江水样的amoA基因与pH正相关.Cao等究发现：珠江口底泥中古菌的amoA基因丰度与pH正相关，这和本研究结果相一致。
2.5 AOA和AOB的系统发育分析
此研究中获取的占菌amoA基因序列分为2种属，即Nitrososphaera和Nitrosopumilus(图3(a))。从-样点红旗水库ososphaera属，百分比分别为83%和93%;
从采样点龙库沉积物中获得的古菌amoA基因序包含57%的Nitrosopumilus和43%Nitrososphaera(图4(a))。NH4+-N浓度和不同采样点沉积中Nitrososphaera属含量呈负相关，和Nitrosopumii属呈正相关。
细菌amoA基因系统发育分析表明主要Nitrosomonas oligotropha, Nitrosospira,N. EuropatNc.mobilis和Undefined-N—Europaea/Nc.mobilis类(图3(b)。从采样点狮子山坝和龙库沉积物中获取细菌amoA基因序列主要为Nitrosospira（分别61%和52%]；从采样点红旗水库沉积物中含量最多Nitrosomonas oligotropha( 49%)，其余Nitrosospira,F,uropaea/Nc.mobilis和Undefined -N. Europaeaflmobilis类群占有百分比相近。除了主要的Nitrosospir狮子山坝和龙库沉积物中分别含有33%、42%Nitrosomonas oligotropha，采样点红旗水库和狮子坝沉积物中均含有上述4种细菌amoA基因类群，采样点龙库沉积物中没有Europaea/Nc.mobilis类(图4(b))。
分析发现Nitrosomonas oligotropha所占相对分比和TN、N03- -N以及pH正相关。Nitrosospira占相对百分比与TN和pH负相关。Ⅳ．Europaeaflmobilis和Undefined-N. Europaea/Nc.mobilis类群占相对百分比均正相关于pH和TN浓度。综上发现TN以及pH对氨氧化古菌和氨氧化细菌的群落组有重要影响。氮元素作为硝化反应的底物，浓度不影响氨氧化菌群落组成，pH则通过对不同形态氮影响而影响氨氧化微生物群落组成。
3结论
(1)花山流域东源、中源和西源的3个采样点积物样品中，所有的细菌amoA基因丰度均高于古amoA基因丰度。采样点红旗水库沉积物中古菌amoA．基因丰度最高（l.72xl06拷贝/g干沉积物），而采样狮子山坝的最低（l.51xl05拷贝／g干沉积物）。不同积物样品细菌amoA基因丰度由大到小依次为采点龙库（2.1lxl08拷贝／g干沉积物）>采样点狮子山（6.40xl07拷贝儋干沉积物）>采样点红旗水库(2.02107拷贝/干沉积物)。
(2) Shannon-Weiner（H’）多样性指数和SChaol 指数表明：狮子山坝沉积物样品中古菌amoA基因丰最高而红旗水库样品细菌amoA基因丰度最高。
(3)古菌的amoA基因丰度与pH以及TN浓呈现显著的正相关关系，细菌amoA基因OTUs数目显正相关于pH以及TN。
(4)古菌amoA基因序列分为2种属，即Nitrosos-phaera和Nitrosopumilus，细菌amoA基因系统发育分析表明：本研究中得到的细菌amoA基因主要有Nitro-somonas oligotropha,Nitrosospira,N. Europaea/Nc.mobilis和Undefined -Ⅳ．Europaea/Nc.mobilis类群。
pH和TN浓度对群落结构有重要影响。
