作者：郑晓蒙
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1样品采集
样品采自河北省廊坊市固安县青贮窖中，样品采集到样品袋后迅速压实排空空气，4℃保存。
1.1.2培养基
MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基、明胶培养基、吲哚试验培养基、H2S试验培养基、硝酸盐培养基、葡萄糖产酸产气培养基、PY培养基。
1.1.3试剂
细菌基因组DNA提取试剂盒、溶菌酶、蛋白酶K、Es-Taq酶、DL2000 DNA Marker和dNTP:北京康为世纪生物技术有限责任公司；Goldview染色液和琼脂糖：广东瑞泰生物药业有限公司；乳酸菌糖发酵生化鉴定管：青岛高科园海博生物技术有限公司。
1.1.4仪器与设备
TG16G台式高速离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；ND-1000型微量紫外分光光度计：Thermo科技公司；DYY-12型电泳仪：北京市六一仪器厂；Fluorchem Xplo型荧光一可见光凝胶成像分析系统：南京非同科技有限公司；DT502A电子天平：常熟市砝码仪器有限公司；SW-CJ-IF单人双面超净工作：台苏净安泰空气技术有限公司；LS立式压力蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备有限公司；恒温培养箱：宁波江南仪器厂；79-2型双向磁力搅拌器：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；PHS-3C精密pH计：上海雷磁仪器厂；超低温冷冻储存箱：中科美菱集团有限公司；MJ Mini PCR仪：伯乐生命医学产品有限公司；双筒显微镜：日本OYLMPUS；移液枪：上海大龙医疗有限公司。
1.2方法
1.2.1乳酸菌的分离与纯化
称取10 g样品于90 mL的无菌水中，于37℃恒温摇床厌氧培养3h备用，经梯度稀释后，取不同浓度的稀释液100 μL，均匀涂布在加有碳酸钙的MRS琼脂培养基上，将平板置于厌氧培养盒后37℃培养72 h，在培养好的平板挑取产生溶钙圈的单菌落，多次划线纯化培养得到纯种菌株。
1.2.2乳酸菌的鉴定
1.2.2.1 形态学特征鉴定
观察菌落形态，记录菌落大小、颜色、凹凸等情况，将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的菌株初步定为乳酸菌，并进行油镜镜检，根据菌种的形态学特征将其分为杆菌和球菌。挑取17个符合1.2.1条件的单菌落至MRS肉汤培养基中，37℃培养24 h后将菌落分别转接到甘油管中-80℃保存和试管斜面培养基4℃保存。
1.2.2.2生理生化特征鉴定
17株菌株的糖、醇类发酵、明胶、硝酸盐还原、吲哚、精氨酸分解、葡萄糖产酸产气、生长等生理生化试验均参照《常见细菌系统鉴定手册》进行。
1.2.2.3 分子生物学鉴定
1.2.2.3.1 DNA的提取
将分离纯化的乳酸菌培养12 h后，按照试剂盒进行DNA提取和纯化。
1.2.2.3.2 PCR扩增
参照文献[13 -14]所用的乳酸菌通用引物正反向引物分别为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’．5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’，由北京赛百盛生物技术有限公司合成。PCR反应体系见表1，PCR反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸，72℃终延伸2 min，35个循环。72℃延伸smin，降温至120℃。取出扩增后的PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，经Goldview染色后，用凝胶成像系统观察目的基因电泳条带，并拍照记录。
1.2.2.3.3 16s RNA序列分析
16s rDNA扩增产物经纯度检测后，由北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序完成，将结果在Gen Bank中进行B LA ST分析。
1.2.2.3.4系统发育树的构建
使用软件Clustalx l.83和MEGA 5.0对进行分离菌株系统化分析并采用临近法绘制系统发育树。
1.2.3特性研究
1.2.3.1 产酸能力测定
将活化的17株乳酸菌按体积分数2%接种量接种至pH 6.5的MRS液体培养基中，于37℃恒温培养24h，每2h测定个组菌液pH。
1.2.3.2生长曲线的测定
将活化的17株乳酸菌按体积分数2%接种量接种，30 mL MRS液体培养基中，37℃恒温培养24 h，以不接菌的培养基为空白对照，每2h用紫外分光光度计于600 nm下，测定各组OD值，绘制生长曲线图。
2结果与分析
2.1形态学特征
17株乳酸菌均为乳白色或浅黄色，中间凸起，边缘整齐的圆形菌落，革兰氏染色呈阳性，过氧化氢酶试验阴性，镜检杆菌细胞形态，细胞形态为长杆状、中长杆状、短粗杆状，呈单、对、堆或链状排列；球菌呈圆形或卵圆形，以单个、成对或链状排列。
2.2生理生化特性
经生理生化鉴定后，菌株3，5．6，8，11，13，15和16与Lactobacillus plantarum特征一致，菌株1，4和1 0与Lactobacillus fermeutum特征一致，菌株9与Lactobacillus casei特征一致，初步鉴定此12株菌为乳杆菌属，菌株7，14和17与Pediococcus acidilactici特征一致，初步鉴定三株菌为乳球菌属，菌株2和12无法确定。列出生理生化鉴定结果如表2。
2.3分子生物学鉴定
2.3.1基因组提取结果
用细菌基因组DNA提取试剂盒对17株菌株进行处理，将所得待测菌株DNA，用微量紫外分光光度计检测DNA纯度及含量。基因组DNA检测结果表明，17株乳酸菌质量浓度和纯度均能满足16s rDNA扩增和进一步测序需要。如表3。
2.3.2 16s DNA扩增结果
菌株的PCR检测结果，通过PCR扩增获得1 500 bp左右的目的片段，与预期扩增大小一致，说明扩增成功。如图1。
2.3.3 16s RNA序列分析
将各菌株的16s RNA基因测序测通结果在GenBank中进行BLAST序列比对分析，各菌株与已知菌株的同源性均达到99%（表4）。菌株3，5，6，8，1 1，13，15和16被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），菌株1，4和10被鉴定为玉米乳杆菌（Lactobacillus zeae），菌株7，14和17被鉴定为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），菌株2香肠乳杆菌（Lactobacillus farciminis），菌株9被鉴定为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），菌株12被鉴定为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）。
2.3.4系统发育树的构建
依据同源性分析结果，从Gen Bank中挑取21株相似度较高（均达到99﹪）的16s rRNA基因序列，进行系统进化树的构建，见图2~图3。结果发现，菌株3，5,6,8,11,13,15和16与Lactobacillus plantarumstrain的亲缘关系比其他菌株近，可以鉴定它们为植物乳杆菌。菌株1，4和1 0与Lactobacillus zeae strainKC755105.1的亲缘关系比其他菌株近，可以鉴定它们为玉米乳杆菌。菌株7，14和17与Pediococcus acidilactici strain的亲缘关系比其他菌株近，可以鉴定它们为乳酸片球菌。菌株2与Lactobacillus farciminisstrain的亲缘关系比其他菌株近，可以鉴定它为香肠乳杆菌。菌株9与Lactobacillus casei strain EU755260.1的亲缘关系比其他菌株近，可以鉴定它为干酪乳杆菌。菌株12与Lactobacillus paracasei strain KF149638.1的亲缘关系比其他菌株近，可以鉴定它为副干酪乳杆菌。
2.4产酸速率的测定（见表5）
通过对17株菌进行产酸能力测定，选择产酸能力强的菌株，17株菌均具有一定的产酸能力，各菌株pH在2—10 h变化最快，14 h后各菌株的pH基本稳定。从表5可以看出，15菌株产酸速率最快，开始培养至6h后pH就降至4.0以下，10 h后降至3.5以下。菌株3和9次之，开始培养至8h后pH降至4.0以下，14 h后降至3.5以下。菌株6，8，11，15和16五株菌也在培养开始后的10 h时pH降至4.0以下，也表现出了较好的产酸性能。
2.5生长曲线测定
由图4可见，菌株5进入适应性较强，接种2h之内生长速率就比较快。菌株3，6，8，9，11，15和16均在接种后2—4 h进入对数生长期，在4—10 h时生长速度达到最快，10—12 h开始进入稳定生长期，进入对数期生长速率基本一致，12 h时左右进入稳定期，此后OD值的变化较小，从20 h开始OD值开始有下降的倾向，说明菌株开始衰老。大部分菌株发酵过程中没有明显的迟滞期，说明在MRS液体培养基中的代谢活动比较快，能很快进入细胞的分裂期，使细胞数目快速增长。
3结论
严萍和热娜·米吉提等从新疆地区青贮饲料中分离的乳酸菌主要为明串珠菌属、乳杆菌属和肠球菌属。何轶群等从甘肃地区青贮中分离的乳酸菌主要有戊糖片球菌，植物乳杆菌，发酵乳杆菌，肠系膜明串珠菌肠膜亚种和屎肠球菌。试验从河北地区自然发酵的青贮中分离出8株植物乳杆菌，3株乳酸片球菌，3株玉米乳杆菌，1株香肠乳杆菌，一株干酪乳杆菌和1株副干酪乳杆菌，说明青贮体系微生物的种类受青贮的种类、产地及发酵条件的影响。Pang等从玉米秸秆上提取并鉴定乳酸菌，其中40﹪是植物乳杆菌，与试验的研究结果基本一致，说明植物乳杆菌是青贮饲料乳酸菌菌群中的优势菌群。
试验采用了形态学特征、生理生化特性和分子生物学特征相结合的研究方法，从自然发酵青贮饲料中分离出乳酸菌菌株，构建了系统发育树并鉴定到了种。结果表明，菌株3，5，6，8，11，13，15和16为植物乳杆菌，菌株4，10，1为玉米乳杆菌，菌株7，14和17为乳酸片球菌，菌株2为香肠乳杆菌，菌株9为干酪乳杆菌，菌株12为副干酪乳杆菌。并通过对其产酸速率和生长曲线的测定，筛选出了8株优良乳酸菌菌种（3，5，6，8，9，1 1，15和16）。八株乳酸菌有生长速度快，产酸速度快的优良特性为原料顺利发酵起着重要的作用，进一步研究菌株的生长特性和相互之间的影响，可以将菌株经过比例复合进行混合菌株发酵，更好地开发其发酵品质和潜在的益生特性。
摘要 为了筛选性状优良的乳酸茵菌株，通过细菌形态学、生理生化特征鉴定和16s rRNA序列分析，从天然发酵玉米饲料中分离纯化出17株菌株，8株植物乳杆菌(3，5，6，8，11, 13, 15和16),3株玉米乳杆菌(1，4和10),3株乳酸片球菌(7，14和17),1株香肠乳杆菌(2)，1株干酪乳杆菌(9)，1株副干酪乳杆菌(12)。通过测定产酸速率和生长曲线筛选出3，5，6，8，9，11, 15和16为产酸较快、生长迅速的优良乳酸菌菌株。
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