低成本消除水体污染的最新措施

     作者：郑晓蒙

    微污染水体异养硝化菌筛选研究进展内容简介：

    河流、湖泊水体中氨氮含量超标是我国水体污染的主要原因之一，氨氮超标引起水体富营养化，直接威胁到当地的水环境和水生态安全，因此作为水体污染的重要污染物之一，受到人类的高度关注。目前，国内外常用的污水脱氮的方法分为物理化学方法和生物脱氮方法。而生物脱氮具有设备简单，运行成本较低，且能高效而彻底地完成脱氮任务等优点，被认为是最经济有效的脱氮方法。

    传统生物脱氮理论认为，生物脱氮是由自养型的硝化、亚硝化细菌和异养型的反硝化细菌共同作用完成。其中硝化、亚硝化细菌在有氧条件下将氨氮转化为硝态氮，称为硝化作用，兼性厌氧的硝酸盐还原菌将硝酸盐还原为氮气的过程称作反硝化作用。1949年，Quastel等首次培养出产NO2-的硝化菌，但直到20世纪80年代，Robertson等在实验研究中，利用选择培养基筛选出具有异养硝化一好氧反硝化作用的Thiosphaera pantotropha菌，异养硝化概念才逐渐被人们所认可。不同于自养硝化，异养硝化是微生物在利用有机底物的同时将氨氮转化为羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐的过程，并且异养硝化菌具有生长速度快、溶解氧浓度要求低、COD与氨氮去除率较高等诸多优点，异养硝化菌的研究越来越受到人们的重视。

    l  异养硝化菌代谢途径

    异养硝化菌在进行代谢过程中，可进行无机途径也可进行有机途径。因此其作用底物可以是有机氮，如丙酮酸肟、氧肟酸、N-烷基羟胺等，也可以是无机氮，如胺、酰胺等。Zhao等用丙酮酸肟作为底物研究异养硝化菌的代谢途径，丙酮酸肟经无机途径转化为羟胺和丙酮酸，羟胺进一步分解生成亚硝态氮；经有机途径，丙酮酸肟直接分解成亚硝态氮。Robertson等利用N标记化合物和质谱确定氮转化的中间产物，发现异养硝化菌进行硝化作用时，利用无机氮和利用有机氮的硝化途径不同，利用无机氮作为底物时，中间产物是NH2OH，而利用有机氮作为底物时，中间产物是NHOH -，硝化途径如图1所示。

    传统工艺中，硝化作用是在好氧条件下产生，反硝化作用是在厌氧条件下产生，这使得整个脱氮环节必须经过好氧和厌氧2个环节。异养硝化一好氧反硝化菌能够在好氧条件下进行反硝化作用，使得硝化作用与反硝化作用同时进行，除去NO3-的同时还消耗了O2，作用产物主要是N2，也有少量菌种产生的是N2O。

    Richardson等在对异养硝化菌进行深入研究后，提出了较为详细的脱氮假想途径，认为硝化作用和反硝化作用的结合点在亚硝酸盐水平，在异养硝化菌代谢途径中，起作用的酶有氨单加氧酶( AMO)、羟胺氧化酶(HAO)、硝酸还原酶(NAR)、亚硝酸还原酶( NIR)，其中起关键作用的酶为AMO和HAO。氨氮在AMO作用下被氧化成NH2OH，而HAO不仅能氧化羟胺成NO2-，也能催化NO2-与羟胺合成N2O，经过一系列反应最终以氮气形式排出，

相关酶如图2所示。

    (1)氨单加氧酶

    AMO既存在于自养型硝化细菌也存在于异养型硝化细菌，可直接利用的底物是NH3而非NH4+；对光敏感，紫外线的照射可以抑制其活性；可利用的底物范围很广，已知的底物有40余种。Moir等从脱N副球菌Pd1222中获得了部分纯化的氨单加氧酶，以NADH、硫辛酰胺脱氢酶以及四甲基对苯醌为电子受体，监测细胞悬液或细胞提取液依赖于胺的氧消耗速率的方法来确定氨单加氧酶酶活。

    (2)羟胺氧化酶

    HAO是一个单体蛋白，含有铁离子，不含血红素，Fe3+或者Fe2+可激活羟胺氧化活性，但EDTA对其有明显抑制作用。异养硝化菌的HAO与自养型硝化细菌不同，可将羟胺转化为NO2-及少量N2O；在厌氧或微好氧情况下可将羟胺直接转化为N2O。已筛选出来的异养硝化菌HAO产物多为硝酰化合物，且该过程为好氧过程，需要充足的O2参与。

    安强等利用超声波法提取粗酶并用硫酸铵分级沉淀法富集纯化粗酶提取液，取得良好的粗酶提取效果，通过检测系统中的NH4+ -N和NH2OH-

N的浓度，分别确定AMO和HAO的活性。得到在好氧条件下，所研究菌株Alcaligenes faecalis strain NR的AMO和HAO的酶比活力分别是0.011、0. 016 U/mg protein的结论，从而验证菌株的硝化性能。

    (3)硝酸还原酶和亚硝酸还原酶

    NAR和NIR属于氧化还原酶，由硝酸盐、亚硝酸盐诱导，而受抑制于有机氮和NH，。异化型酶存在于许多兼性好氧性细菌，不易溶于膜结构。NAR和NIR存在于硝酸盐、亚硝酸盐阶段，是异养硝化菌NO2-和NO3-积累量偏低的主要原因。

    2异养硝化菌筛选方法

    2.1  间歇曝气法

    异养硝化一好氧反硝化菌在好氧反硝化阶段可以利用O2和NO3-作为其电子受体，因此可以创造一个有氧和无氧环境交替的条件，使完全好氧菌和厌氧菌不能正常生长，从而筛选出异养硝化菌。该方法在实际研究中已得到应用：苏俊峰等采用间歇曝气方式对异养硝化菌富集驯化，并结合传统筛选方法，分离出一株异养硝化菌，最终氨氮去除率52. 13%，且具有产NO2-硝化性能。文屹在其研究中采用微孔曝气的方法完成异养硝化菌的富集。在6个烧杯中投加培养液并分别接种选自曝气池、厌氧池、缺氧池中的污泥，对培养液微孔爆气，曝气量2. 25 L/min，每天停止1h曝气，并更换新鲜FM培养液，30 d完成分离纯化。稀释后经过2次划线分离，得到纯菌。

    间歇曝气法利用反硝化阶段O2和NO3-都可作为其电子受体的原理，保证了异养硝化菌能正常存活，不断挑除其他杂菌，是一个菌种自我选择的过程。

    2.2选择培养基法

    对于培养条件有特殊要求的异养硝化菌的筛选，多采用选择培养基法，根据异养硝化菌代谢特点，选择合适的碳源、氮源、生长因子等配制成适合异养硝化菌生存的培养基，富集环境中的异养硝化菌，再利用平板划线、涂布分离的方法选取单菌落，经过多次纯化，将异养硝化菌筛选出来。王珺等从城市纳污河流中筛选出一株具有异养硝化功能的假单胞杆菌P．stutzeri，异养硝化过程主要发生在菌体的对数生长期，该菌株7d内对NO3- -N和NOx- -N的去除率分别达56. 26%和53. 99%。苏俊峰等从水库底泥中富集分离出一株贫营养型异养硝化菌，优化培养条件后，对氨氮去除效果明显，氨氮质量浓度从9. 02、7.49 mg/L下降到1.83、1. 07 mg/L，最高去除率达91. 42%。

    选择培养基法采用的是传统纯培养技术，针对自然界中的目标微生物，使该目标微生物在特定的生存环境下加富。该方法为微生物筛选最普遍的方法，由于与异养硝化细菌生长的营养元素及生长因子比例相似的异养型细菌较多，选择合适的培养基营养比例是选择培养基法的关键。

    2.3分子生物学筛选

    分子生物手段涉及到的领域广，这一技术能够提供群落中优势种类信息，适合于调查种群的时空变化，并且可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落组成。王光玉等以选择培养基分离筛选异养硝化菌，在富集驯化前、自养富集驯化结束和异养驯化结束3个时间点对氨单加氧酶基因amoA和周质硝酸盐还原酶亚基基因napA扩增，对扩增产物作脂糖凝胶电泳检测，并观察拍照，筛选出具有异养脱氮能力的菌株。该方法可同时分析多个样品，具有可重复性和操作简单等特点。

    3  已筛选出来的菌种

    近年来，研究人员多以铵盐为所筛选微生物的唯一氮源从不同菌源中分离，筛选出异养硝化菌，表1列出已筛选出来的异养硝化菌，除此之外，仍有不少异养硝化菌的种类被筛选出来或正在研究中。

    从表1中可以看出：

    (1)已有的研究多以污水和污泥作为研究对象，从中筛选异养硝化菌。由于底泥中富含水分、矿质离子、有机物、无机物等物质，更适于微生物生长，底泥中菌种的数量和种类多于水体，从底泥中筛选的脱氮菌脱氮效率要优于污水。

    (2)异养硝化菌的筛选需要利用有机碳源，如乙酰胺、乙酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸三钠、葡萄糖、甘露醇、酒石酸钠等，从已有的研究中可以看出，研究中所用碳源多集中于琥珀酸钠和柠檬酸三钠，这与曾庆梅等对最佳碳源的研究结果一致。

    (3)异养硝化菌筛选研究所用氮源可以是无机氮源，如硝酸钾、氯化铵等，也可以是有机氮源，如乙酸钠、尿素、乙酰胺、蛋白胨等。而氮源的化学结构及分子质量也对菌种的异养硝化菌生长周期有影响。韩晓阳等在其研究中以不同碳源与氮源作为培养基元素培养异养硝化菌，结果证明，以无机氮源硫酸铵为氮源时生长量最大；其次是尿素为氮源。

    4最佳培养条件

    异养硝化菌生长受营养元素及生长环境等因素的影响，在不同的营养元素及生长环境下表现出来的生长情况及脱氮效率有所差别，因此需要探寻异养硝化菌的最佳培养条件。

    (1) C/N比

    C/N比是影响异养硝化菌硝化能力的因素之一，也是易调节的一个因素，较高的C/N比有利于氨氮的降解，研究表明，当C/N比>10时，氨氮能被彻底降解。潘丹等也在其研究中指出，异养硝化菌对氨氮的去除效率在C/N比为8时明显大于C/N比为4时。实际配比中，应合理选择C/N比，既能满足氨氮高去除率的要求，又不能过大，使出水COD含量加大。

    (2)pH

    培养条件中的pH不仅影响了异养硝化菌生命活动及硝化作用，也对环境中的NH4+浓度有重大影响。研究表明，适宜异养硝化菌生长与代谢的pH为中性或偏碱性，介于6.5 - 10。在酸性环境下，异养硝化菌生长受抑制，基本无硝化效果。李焱生在其研究中指出，硝化反应关键酶之一的亚硝酸氧化还原酶最适pH位于碱性范围，因而，在偏碱性环境中异养硝化菌硝化作用代谢强度加大。

    (3)温度

温度影响微生物的代谢及体内酶的活性，一定范围内，微生物生命活动及酶活性随温度的上升而增强，异养硝化菌可以生长的温度介于8 – 37℃，温度低于5℃或高于50CC都直接影响菌株体内酶活性。研究指出，异养硝化菌的最适生长温度在30℃左右，而使硝化菌体内酶活性发挥最高时的温度为40℃。但温度较高时N2O、N2等以气体形式挥发出去，因此，多选用最适宜异养硝化菌生长的温度(30℃)为培养温度。

    (4)氧浓度

    溶解氧作为异养硝化菌呼吸链的最终电子受体，关系到生长及还原活性。实验室常用培养摇床的转速控制氧的浓度，对于异养硝化一好氧反硝化菌，提高转速增加培养液中氧浓度，会提升菌种的脱氮效果。但达到一定转速后，溶液中的溶解氧浓度接近饱和，增加转速，溶解氧浓度不再上升，反而会破坏掉溶液中已经形成的微生物群落结构。于大禹等在其研究中设计了不同氧浓度条件下异养硝化菌的培养实验，设定浓度分别为6.4、4.7、1.1 mg/L，结果证明，当氧浓度为4.7 mg/L时，异养硝化作用最好。

    5  总结及展望

    异养硝化菌自被发现以来，人们已从不同角度、不同深度来研究异养硝化菌的特点。有关异养硝化菌筛选的方法，大部分研究仍然选择利用传统的纯培养技术，结合涂布、划线，分离出纯菌种，也有少数研究人员采用曝气法、极限稀释法等，但这些方法仍然基于传统纯培养技术。因此传统的纯培养技术仍然是目前筛选异养硝化菌的主要方法。

环境中微生物种群的复杂性为目标菌种的筛选增加了难度。今后的研究重点应放在：①将分子生物学筛选手段运用到已有的筛选方法之中，在已有的筛选途径基础上优化筛选方法，减少筛选工作量，简化过程；②关于异养硝化菌的作用机理的研究集中于国外，国内缺乏这方面的研究，从异养硝化机理出发，寻求生长周期更短、菌株脱氮效率更高的异养硝化菌。

    6评述：

    简述了异养硝化菌的作用机制，总结了常用的筛选方法和近年来从微污染水源中筛选出来的异养硝化菌种，并归纳异养硝化菌的最佳培养条件，为异养硝化菌的筛选研究提供理论基础。